综述：揭示陆生植物光系统II的结构：从负染电镜到冷冻电镜的历程

本综述系统回顾了陆生植物光系统II（PSII）结构研究的重大进展，从早期负染电镜（EM）技术到现代高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）的突破，揭示了PSII-LHCII超复合体的精细结构、多种结合模式（如C2S2、C2S2M2）及其在物种间的演化多样性，为理解光合作用机理和光适应策略提供了关键结构基础。

　　

早期利用负染电镜进行PSII结构研究

最初关于植物PSII组织和结构的线索来自于20世纪80至90年代对分离类囊体膜的电子显微镜（EM）研究。早期的冷冻断裂电镜和生化研究表明，PSII主要以二聚体复合物的形式存在于堆叠的基粒膜中。除了在类囊体膜中普遍随机分布外，这些二聚体偶尔能组织成规则的晶体阵列，反映在特定生理条件下更有序的横向排列。计算机图像处理技术的引入带来了重要的方法学进步，这些技术用于对齐和平均电子显微镜照片中单个负染颗粒的投影。这些方法通过平均提高信噪比，使得对非晶体生物颗粒的结构分析成为可能，并被应用于分离蛋白质复合物的研究。即使在中等分辨率下，这种方法也能提供有意义的 structural 信息，并为后来的三维重建奠定了基础。

PSII–LHCII超复合体结构分类概念的引入

20世纪90年代中期，计算机平均方法逐渐应用于陆生植物负染PSII超复合体的结构研究。这些分析为PSII及其相关捕光天线蛋白的超分子组织提供了早期见解。Boekema等人的工作代表了来自菠菜的PSII-LHCII超复合体的首次结构表征。这项研究证实了PSII的二聚体性质，并显示根据LHCII三聚体与二聚体核心的结合方式不同，存在不同的结构变体。这突出了PSII-LHCII组装的模块化排列，并暗示了一定程度的结构灵活性，可能反映了生理适应性。后续研究证实，PSII核心二聚体比单体更稳定且功能更强大，强调了二聚化在高等植物中的生理重要性。因此，这些初步的结构研究也为关键PSII核心亚基的空间排列提供了早期线索，包括D1和D2蛋白、内部天线CP43和CP47、细胞色素b₅₅₉以及位于腔面的放氧复合体（OEC）外在亚基，提供了PSII反应中心功能结构的初步见解。

对分离菠菜PSII–LHCII超复合体的更广泛分析揭示，PSII至少以两种不同的模式与LHCII三聚体结合。这项工作引入了众所周知且至今广泛使用的“强结合”（S）和“中度结合”（M）LHCII三聚体的命名，这成为不同PSII超复合体类型分类的基础。基于这些发现，定义了几种超复合体变体，包括C₂S₂、C₂S₂M和C₂S₂M₂，以及更小的组装体如C₂S甚至单独的C₂。这种分类突出了PSII的结构可塑性及其根据环境条件（特别是光强变化）调整天线大小的能力。由于在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中也观察到类似的天线大小调节，这种机制似乎代表了不同植物物种的通用策略。

在后续研究中，鉴定出了第三种更瞬态的LHCII结合模式，称为“松散结合”（L）。包含这个结合位点使得能够描述更大的构型，例如C₂S₂M₂L₂，其中每个PSII二聚体与多达四个LHCII三聚体相结合。这些结果提供了强有力的证据，表明PSII天线系统是可变的且受到动态调控。LHCII三聚体的S、M和L结合位点的鉴定建立了一个框架，该框架至今仍然是各种植物物种（包括绿藻，甚至更远缘的物种如硅藻）中PSII超复合体结构分类的核心。在这些物种中，S/M术语用于描述结构不同的PSII–FCPII超复合体，包括存在FCPII天线蛋白四聚体而非三聚体的形式。

PSII-LHCII超复合体中次要天线蛋白的结构定位

在解析PSII–LHCII超复合体中次要（单体）天线蛋白的空间组织方面取得的重要进展是通过单颗粒电镜、生化方法和遗传研究的结合实现的。早期的见解来自对地钱（Marchantia polymorpha）（最早分化的陆生植物之一）的PSII复合物的交联实验和电镜分析。这些研究提出了LHCB5（CP26）和LHCB4（CP29）的初步位置，并证明了PSII–LHCII超复合体的整体结构，包括LHCII三聚体和单体天线蛋白的紧密关联，在整个陆生植物谱系中是保守的。在此基础上，Boekema等人扩展了PSII–LHCII组装体的分类，并提出了次要天线蛋白（特别是LHCB5和LHCB6（CP24））在稳定超复合体（包括包含L-LHCII三聚体的更大形式）中的作用。尽管结论主要是推论性的，但这些模型帮助定义了关于这些蛋白结构作用的关键假设。

对次要天线蛋白的更明确定位来自于Yakushevska等人的研究，他们使用拟南芥PSII的单颗粒电镜结合反义突变体。LHCB5被放置在超复合体的远端边缘，LHCB4靠近CP47。LHCB4的缺失严重损害了超复合体的形成，而LHCB5的缺失则降低了结构稳定性。LHCB6虽然没有直接解析，但被提议占据C₂S₂M₂构型中的剩余位点。总之，LHCB4-6在PSII核心和LHCII三聚体之间形成了一个结构桥梁，稳定了PSII–LHCII超复合体的模块化结构。

使用负染电镜进行PSII结构研究的下一阶段以Caffarri等人的工作为标志，该工作在当时代表了植物PSII–LHCII超复合体最全面的结构和功能表征。在这项研究中，结合了单颗粒电镜、生化技术和突变体分析，以12 ?的分辨率确定了来自拟南芥的C₂S₂M₂超复合体的结构。该分析提供了超复合体近乎完整的结构图谱，清晰地定位了S型和M型LHCII三聚体以及次要天线蛋白LHCB4、LHCB5和LHCB6的位置。重要的是，这些结构信息得到了广泛的生化数据的支持。通过分析缺乏单个LHCB蛋白的拟南芥突变体，该研究证明了特定亚基如何有助于PSII超复合体的稳定性和组装。这些实验建立了结构特征与功能结果（包括捕光能力和特定条件下的超复合体稳定性）之间的相关性。当时，这种将电镜成像与生化和遗传证据相结合的整合方法，为理解不同PSII组件如何协作以确保有效的能量转移和光保护提供了一个详细的框架。这项研究已成为PSII结构研究领域广泛引用的参考文献，促进了各种形式PSII超复合体模型的发展，并为冷冻电镜时代的到来奠定了基础。

PSII-LHCII超复合体的进化多样性

虽然对拟南芥的结构研究为PSII–LHCII超复合体的组织和稳定性提供了必要的见解，但后续研究逐渐将焦点扩展到模式陆生植物物种之外。目标不再仅仅是提高分辨率，而是探索PSII结构在具有不同进化历史和生态适应性的植物谱系中可能如何变化。在此背景下，在非被子植物物种中启动了比较研究，特别是早期分化的陆生植物和裸子植物，以调查在模型系统中建立的结构原理是否在更广泛的植物界中保守。

近年来的结构研究表明，PSII的组织并非在所有陆生植物谱系中都严格保守。特别是，代表裸子植物的松科（Pinaceae）成员表现出与被子植物不同的PSII-LHCII超复合体组成。对挪威云杉和苏格兰松等物种的研究揭示了关键差异，这些差异指出了PSII在植物进化过程中的结构适应性。与典型的被子植物PSII超复合体（包括LHCB6和LHCB3蛋白）不同，松科以及买麻藤目的代表缺乏这些组分。相反，它们的PSII复合物采用与绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）（一种进化上更古老的生物）中观察到的配置更相似的构型。

这些发现挑战了LHCB3和LHCB6是陆生植物PSII天线系统普遍保守特征的主流观点。进一步调查揭示了松科和买麻藤目的另一个显著特征，即仅存在LHCB4的单一亚型，特别是LHCB4.3（也称为LHCB8），而其他常见亚型LHCB4.1和LHCB4.2则缺失。值得注意的是，LHCB8通常在被子植物中与高光条件相关，支持了松科和买麻藤目中的PSII天线系统在进化历史上已结构适应长期暴露于高光的解释。此外，使用温和去污剂 solubilization 和CN-PAGE分离，我们观察到云杉PSII可以在被子植物中未见过的位点结合额外的LHCII三聚体。这些扩展形式可能对应于C₂S₂M₂L_n类型的超复合体，表明天线容量增加和能量分布具有更大的可塑性。

除了它们的直接功能意义外，这些发现具有更广泛的进化意义。它们表明，种子植物中PSII天线系统的结构多样化代表了一种由环境压力塑造的适应策略。虽然PSII的核心高度保守，但周围的天线组件似乎更灵活，允许植物根据特定地点需求微调其捕光装置。这些观察结果强化了PSII作为一个动态响应系统的观点，它能够在不损害核心功能的情况下进行结构重组。持续的结构分析，特别是使用高分辨率冷冻电镜，可能会提供对这些适应以及塑造陆生植物PSII结构多样性的进化途径的进一步见解。

冷冻电镜时代及对Lhcb蛋白在PSII超复合体中作用的结构见解

从二维负染标本电镜到冷冻电镜的转变标志着光合作用蛋白质复合体结构分析的重大进步。虽然负染电镜提供了PSII超复合体的有价值投影，但冷冻电镜能够以更高的分辨率重建三维密度图。这使得能够以近天然状态可视化蛋白质复合体，揭示单个亚基的空间组织、它们的相互作用以及色素、脂质和其他辅因子（如电子载体）的精确定位。这些进步不仅得益于电子显微镜的技术改进，还得益于样品制备、颗粒挑选、图像处理和计算基础设施方面的显著进展。

植物PSII–LHCII超复合体的首次冷冻电镜重建

冷冻电镜在植物PSII研究中的应用始于2000年代初，建立在早期使用负染电镜取得的进展之上。Nield等人进行了一项开创性研究，他们使用单颗粒冷冻电镜实现了菠菜C₂S₂超复合体的三维重建。尽管24 ?的分辨率按当前标准非常低，但该研究证实了PSII核心及其外周天线在三维空间中的整体排列。关键组件如D1、D2、CP43和CP47被解析，以及LHCII三聚体的排列和形成OEC的外在蛋白在腔面上的定位。值得注意的是，这项工作证明了高等植物和蓝藻的PSII核心之间存在强烈的结构相似性，支持了核心结构的进化保守性。

来自模式被子植物的PSII–LHCII超复合体的高分辨率冷冻电镜结构

PSII–LHCII超复合体的第一个高分辨率冷冻电镜结构来自菠菜和豌豆这两个被广泛研究的被子植物模型。在菠菜中，以3.2 ?分辨率解析的结构揭示了C₂S₂超复合体，而在豌豆中，C₂S₂M₂超复合体以2.7 ?分辨率确定。一个主要的进步是冷冻电镜能够通过可视化单个亚基之间的相互作用来详细研究超复合体的组装。这些图谱还揭示了色素辅因子的精确位置，为激发能量转移途径和类胡萝卜素的光保护作用提供了关键见解。此外，还获得了OEC外在亚基的结构信息。后来使用不同的分离程序为模式生物拟南芥确定了C₂S₂M₂超复合体的可比结构。虽然发现PSII超复合体的整体组织高度保守，但在拟南芥中只解析了OEC的PsbO亚基，而PsbP和PsbQ缺失。这表明拟南芥中OEC的单个组分更脆弱或松散关联，可能反映了亚基相互作用或OEC组装调节方面的物种特异性差异。

此外，冷冻电镜图谱提供了LHCII三聚体、单体天线蛋白LHCB4-6和核心复合体之间相互作用的详细视图，这些特征在早期负染标本的二维投影中无法解析。S-LHCII三聚体不仅由LHCB5和LHCB4稳定，还通过与CP43和PsbW的广泛接触稳定。M-LHCII三聚体主要通过LHCB6和LHCB4与核心相互作用，并得到与S-LHCII三聚体共享的结构界面的额外稳定。LHCB4在桥接S和M三聚体与核心方面起着核心作用，与D1、CP47、PsbH、PsbL相互作用，并且在M三聚体的情况下，还与LHCB3形成接触。

单体天线蛋白在PSII–LHCII超复合体的特定组装和结构完整性中的重要性从缺乏单个单体天线亚基的拟南芥突变体的分析中显而易见。它们缺失的一个常见后果是要么失去更大的PSII–LHCII形式（C₂S₂M₂、C₂S₂M），要么至少，在分离过程中超复合体稳定性降低。后者是缺乏LHCB5的植物的特征。虽然CP26曾被认为是可有可无的，但应用非常温和的分离程序使得能够对来自lhcb5突变体的C₂S₂M₂超复合体进行单颗粒电镜分析，揭示其缺失 destabilizes S和M三聚体的位置并改变它们的取向。未能从lhcb4和lhcb6拟南芥突变体中分离出C₂S₂M₂进一步证实了LHCB4和LHCB6在稳定M-LHCII结合中不可或缺的作用，因为只能回收更小的超复合体如C₂S₂。这些发现强调了单体LHCB蛋白在PSII–LHCII超复合体的组装、灵活性和光依赖性重塑中的关键结构作用。

裸子植物PSII-LHCII超复合体的比较冷冻电镜分析

除了主流模型物种外，对其他陆生植物PSII的结构研究开始揭示新的结构和功能特征。最近对挪威云杉（裸子植物代表）PSII C₂S₂超复合体的冷冻电镜研究揭示了与被子植物相比的几个显著差异。最重要的发现之一是对LHCB4.3（也称为LHCB8）的高分辨率模型，它是LHCB4的一个截短亚型，缺乏LHCB4.1和LHCB4.2中发现的延长C端区域，并且代表云杉中存在的唯一LHCB4样亚型。

LHCB4.3的主要结构作用是从拟南芥和豌豆的观察中推断出来的，在这些植物中，它取代LHCB4.1/2的掺入与M三聚体的 destabilization 以及在高光条件下从C₂S₂M₂向更小的C₂S₂超复合体转变相关。这些结构发现得到了拟南芥突变体功能分析的支持，其中用携带单个点突变（在叶绿素结合残基Chl b614）的LHCB4.1版本补充lhcb4系，破坏了其与LHCB6的相互作用，随后 destabilized M三聚体结合。相比之下，云杉型配置表明，即使在没有LHCB6和LHCB3的情况下，LHCB4.3也能稳定地支持M三聚体结合，这表明在这种裸子植物物种中已经进化出一种替代的稳定机制。

同一项冷冻电镜研究还鉴定出了辅助亚基Ycf12，并且显著地，在CP43和S-LHCII三聚体之间的界面处解析了一个α-生育酚（维生素E）分子。这种以其淬灭单线态氧的作用而闻名的分子，可能在高光条件下作为PSII功能的氧化还原敏感调节剂。LHCB8和α-生育酚在一个结构不同的PSII–LHCII超复合体中的鉴定，突出了将结构分析扩展到传统模式生物之外的重要性。这类工作继续揭示植物谱系中天线组成、辅因子整合和光保护机制方面意想不到的适应。

S型和M型LHCII三聚体的亚基组成

通过高分辨率冷冻电镜，陆生植物PSII超复合体中S型和M型LHCII三聚体的亚基组成已经以越来越高的置信度得到解析，尽管并非所有亚型在每個物种中都能明确指定。在被子植物中，S三聚体通常由LHCB1和LHCB2亚基的组合组成。鉴于LHCB1 : LHCB2 : LHCB3的表达比率（在拟南芥中约为8:3:1），假定存在同源和异源三聚体。来自拟南芥、菠菜和豌豆的冷冻电镜数据支持这种可变性，因为单个LHCB1和LHCB2单体的密度在两种亚基氨基酸序列不同的位置通常局部不太明确。因此，分辨率通常不允许直接区分LHCB1和LHCB2。在分离的菠菜LHCII三聚体的X射线晶体结构中也观察到类似的局限性。然而，最近对拟南芥C₂S₂超复合体的冷冻电镜分析揭示，S-LHCII三聚体是由两个LHCB1亚基和一个LHCB2亚基组成的异源三聚体，其中LHCB2位于与PSII核心复合体的界面处，而两个LHCB1亚基占据外围位置，分别与CP26和M-LHCII三聚体相互作用。

相比之下，M三聚体显示出更特异和不对称的亚基组成。来自豌豆的高分辨率冷冻电镜重建根据独特的结构特征（如独特的N端和AC环构象以及更长的BC环）将M三聚体的一个单体鉴定为LHCB3。LHCB3实现了不同的相互作用几何形状，特别是与LHCB6和LHCB4，并被认为在M三聚体结合中起稳定作用。这一结构作用得到了拟南芥突变体研究的支持，其中LHCB3的缺失导致M三聚体的取向改变甚至稳定性降低。在我们自己对LHCB3缺陷突变体的结构分析中，我们观察到M三聚体可以采用替代的结合配置，让人想起在裸子植物如挪威云杉中看到的排列，进一步表明LHCB3虽然对超复合体形成不是必需的，但可以微调PSII天线结构并可能影响能量转移动力学。

关于LHCII三聚体组成的额外见解来自挪威云杉PSII的冷冻电镜结构，它提供了迄今为止最均匀的LHCII重建之一。在这种裸子植物中，S三聚体被鉴定为由LHCB1独家组成的同源三聚体。这种同质性可能反映了裸子植物与被子植物相比亚型多样性减少，并且可能代表了对高光环境的进化适应。跨物种的比较说明，虽然PSII–LHCII超复合体的总体结构是保守的，但单个LHCII三聚体的亚基组成既灵活又具有物种特异性。

PSII超复合体更大组装体的结构研究及其在类囊体膜中的组织

PSII超复合体在类囊体膜中并非孤立运作；相反，它们可以通过与邻近蛋白质复合体的特定相互作用形成更大的组装体。其中最突出的是PSII–PSII mega复合体，它们可以在单个膜平面内（膜内mega复合体）或通过基质间隙跨相邻类囊体膜（膜间mega复合体）发生。在较少见的情况下，PSII也可以与PSI相互作用形成异源mega复合体，尽管这种相互作用的结构基础仍不清楚。

虽然PSII–PSI mega复合体已通过生化方法和低分辨率电镜观察到，但它们的精确结构组织仍有待阐明。相比之下，PSII–PSII mega复合体越来越得到很好的表征。分离的mega复合体的单颗粒电镜研究揭示了PSII超复合体之间独特的平行和非平行相互作用，反映了它们形成灵活且功能响应的膜组装体的能力。这些相互作用通常涉及单体LHCB蛋白，如LHCB5，和LHCII三聚体，以及PSII核心复合体的外周亚基，这些亚基介导超复合体之间的横向接触。不同形式PSII mega复合体的生理学意义得到了它们直接在基粒膜中被鉴定的支持。

LHCB5在PSII mega复合体形成中的关键作用最初是基于结构观察提出的，并最近通过lhcb5突变体的电镜分析得到证实。在缺乏LHCB5的情况下，发现PSII mega复合体在分离时高度不稳定，并且只能检测到有限