整合网络药理学、单细胞RNA测序与分子对接揭示延胡索治疗神经病理性疼痛的多靶点机制

本研究针对神经病理性疼痛(NP)治疗中存在个体差异大、疗效不一致的临床难题，通过整合网络药理学、单细胞RNA测序(scRNA-seq)和分子 docking技术，系统解析了传统中药延胡索(Yanhusuo)的多组分-多靶点作用机制。研究发现延胡索中9种生物碱类活性成分可通过调控ACTB/PTEN/ERK1等核心靶点，干预焦点粘连(focal adhesion)和PI3K-Akt信号通路，显著抑制巨噬细胞与卫星胶质细胞(SGCs)之间的病理性通讯，为开发神经病理性疼痛的多靶点治疗策略提供了重要理论依据。

　　

神经病理性疼痛（Neuropathic Pain, NP）如同一个顽固的"神经幽灵"，困扰着全球1-5%的人口。这种由躯体感觉神经系统损伤或功能障碍引发的慢性疼痛，不仅表现为自发性疼痛发作和异常性疼痛，还常伴随感觉功能异常。当前主流治疗药物如加巴喷丁类药物、抗抑郁药和阿片类药物，不仅对相当比例患者疗效有限，更面临头晕、嗜睡和成瘾风险等副作用挑战。这种治疗困境与肿瘤治疗领域曾面临的难题惊人相似——单一靶点治疗往往因通路代偿激活而失效，正如Sonkin等人强调的，针对复杂疾病需要转向多靶点组合治疗和通路药理学策略。

在这种背景下，传统中药延胡索（Yanhusuo）引起了研究人员的特别注意。这种沿用数百年的中药材以其干燥块茎入药，以其卓越的镇痛和抗炎特性闻名，特别是其生物碱类成分能有效缓解急性痛、炎性痛和神经病理性疼痛，且不会产生耐受性。然而，就像许多传统中药一样，延胡索治疗NP的具体分子机制始终笼罩在神秘面纱中。

为了揭开这层神秘面纱，Liu等人在《Hereditas》发表了创新性研究，采用了一种整合多组学技术的系统生物学方法。研究人员首先通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术解析了背根神经节（DRG）的细胞异质性，特别聚焦于巨噬细胞亚型的功能分化和细胞间通讯网络；接着运用网络药理学方法筛选延胡索的活性成分及其作用靶点；最后通过分子对接验证关键化合物与靶蛋白的结合能力。这种多技术联用的策略为理解传统中药的多靶点作用机制提供了全新视角。

研究人员主要采用了几个关键技术：从GEO数据库获取的SNI模型单细胞RNA测序数据（GSE174430）用于构建DRG免疫细胞图谱；通过TCMSP数据库筛选延胡索活性成分（口服生物利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18）；利用STRING数据库和Cytoscape构建蛋白互作网络；采用DAVID进行GO和KEGG富集分析；使用AutoDock Vina进行分子对接验证（结合能<-5.0 kcal/mol视为强结合）。

NP单细胞转录组图谱分析

通过对12个样本（6个SNI组织和6个naive对照）的scRNA-seq分析，研究团队在质控过滤后获得9,867个高质量细胞，通过UMAP降维鉴定出22个细胞簇，最终注释为10个主要细胞类型：巨噬细胞（Cd14⁺、Cd68⁺）、施旺细胞（Ncmap⁺）、卫星胶质细胞（SGCs）（Fabp7⁺）、淋巴细胞（Il7r⁺）、内皮细胞（Cldn5⁺）、神经元（Tubb3⁺）、周细胞（Rgs5⁺）、红细胞（Hbb-bt⁺）、髓系细胞（Cd33⁺）和成纤维细胞（Dcn⁺）。比较分析发现SNI组织中巨噬细胞比例比naive对照组增加了约3.5倍，提示巨噬细胞在NP发生发展中扮演重要角色。

单细胞转录组分析巨噬细胞

进一步对630个DRG巨噬细胞进行亚群分析，识别出5个转录 distinct的亚簇，包括髓鞘相关巨噬细胞（MAMs；P2rx4⁺、Csfl1r⁺）、疾病相关小胶质细胞（DAMs；Ccr2⁺）和血管周巨噬细胞（PVMs；Vegfb⁺）。SNI组中DAMs的比例比Naive组增加了约0.75倍，表明DAMs在NP发病机制中具有重要作用。

伪时间轨迹分析

通过Monocle2进行的伪时间轨迹分析揭示了巨噬细胞的三种 distinct状态，其中State 1被指定为发育起源。根据伪时间轴上的表达趋势，差异表达基因被分为四个模块：模块1（绿色）包含在伪时间早期表达达到峰值随后下降的基因（Dab2、Maf、Stab1）；模块2（蓝色）包含具有双相表达的基因，初始表达低，在轨迹中期达到峰值然后下降（Ccl8）；模块3（紫色）由晚期激活的基因组成，显示逐渐上调（Crip1、Tmsb10）；模块4（粉色）包括在伪时间内持续上调的基因（S100a4）。这些动态变化基因的功能富集分析显示它们分别参与淋巴细胞介导的免疫、免疫细胞增殖、细胞骨架重塑和抗原处理呈递等生物过程。

细胞通讯分析

细胞通讯分析显示，SNI组织中的细胞间相互作用频率和信号强度显著高于naive对照组。巨噬细胞与SGCs之间的相互作用成为失调的主导轴心。系统 pathway筛查鉴定出SNI中六个信号轴的显著激活：Lgals9-CD44（半乳糖凝集素9-CD44轴）、Pros1-Tyro3（蛋白S-TAM受体）、Sema4a-Plxnb1（信号素4A-plexin B1）、Sema4d-Plxnb2/3（信号素4D-plexin B2/B3）。这些信号通路共同 orchestrate神经-免疫交叉对话，构成了病理细胞通讯的潜在调控靶点。

药物-疾病相互作用基因和通路

从GEO数据集获得的转录组数据中，鉴定出SNI组织中的677个差异表达基因（DEGs）——542个上调和135个下调。延胡索相关靶点（n=832）与SNI相关基因的交集产生了53个共同基因。功能富集分析显示这些基因显著富集于6个生物过程和KEGG通路，包括"癌症中的蛋白聚糖"、"PI3K-Akt信号通路"和"焦点粘连"，突显了它们在延胡索治疗作用中的关键角色。构建的多靶点网络整合了五个核心通路：焦点粘连（机械转导和神经元存活）、FoxO信号（氧化应激调节）、甲状腺激素信号（代谢调节）、前列腺癌（细胞增殖控制）、胶质瘤信号（胶质细胞-神经元交叉对话）。

焦点粘连信号通路

基于焦点粘连相关通路建立了靶点-通路网络，其中关键基因如ACTB、AKT1、CCND1、EGF、ITGA2B、PPP1CA、ERK1、PRKCA和PTEN表现出突出的拓扑排名。这些通路在共享靶点上的汇聚表明延胡索对NP的治疗效果源于多通路调控。在NP背景下，延胡索主要参与两个信号机制：焦点粘连通路和PI3K-Akt信号通路。图中的关键节点成分如GF、ITGA、PKC、PTEN、MLCP、Akt/PKB、ERK1/2、CycD和Actin展示了显著的功能参与。

分子对接

分子对接分析了9个优先化合物（Corynoloxine(API1)、dehydrocavidine(API2)、dehydrocorobine(API3)、leonticine(API4)、methyl-[2-(3,4,6,7-tetramethoxy-1-phenanthroyl)ethyl]amine(API5)、pontevedrine(API6)、quercetin(API7)、saulatine(API8)和ST057701(API9)）与关键分子靶点（ACTB、AKT1、CCND1、EGF、ITGA2B、PPP1CA、ERK1、PRKCA和PTEN）的结合情况。计算筛选发现了特定的分子配对具有显著的配体-受体结合亲和力：ACTB-API2(-9.00 kcal/mol)、ACTB-API8(-9.30)、ERK1-API2(-9.40)、PPP1CA-API1(-9.10)和PTEN-API1(-9.20)，这些结果均低于-7.0 kcal/mol的强结合阈值。

研究结论与讨论部分强调，这项工作系统绘制了延胡索在NP治疗中的多靶点、多通路治疗 landscape，为机制研究和药物发现提供了战略基础。鉴定出的生物活性候选物代表了有前景的NP治疗候选药物。研究发现SNI后DRG中的SGCs通过间隙连接通讯和炎症因子释放迅速激活，建立神经元-SGC功能单元，放大神经元兴奋性并驱动中枢敏化。激活的SGCs通过分泌趋化因子进一步招募外周巨噬细胞浸润DRG。巨噬细胞衍生的Sema4d与SGCs上的Plxnb1受体结合，启动下游信号级联如PKC、ERK1/2和Akt/PKB通路。这些通路可能诱导焦点粘连相关基因（如GF、ITGA、PTEN）的转录变化。损伤后，配体介导的Lgals9-Cd44轴激活促进了CD44胞内结构域与肌动蛋白细胞骨架的相互作用，破坏了肌动蛋白动力学，损害了细胞骨架重塑、细胞形态和迁移。焦点粘连通路的失调增强了细胞-细胞粘附，加剧了炎症反应，并放大了疼痛信号传播。

这些发现共同表明，延胡索的生物活性成分通过配体-受体相互作用调节多个信号轴，包括Sema4d-Plxnb1/2/3、Lgals9-Cd44和焦点粘连通路。这种多通路参与可能通过减少炎症反应、调节细胞迁移和细胞骨架重塑以及促进组织修复来减轻NP——这些机制共同改善临床预后。然而，这些效应背后的精确分子相互作用需要进一步的实验验证。

研究的局限性包括生物活性化合物和靶点数据来自文献和数据库，因此预测的可靠性取决于数据质量；此外，本研究采用数据挖掘方法，需要临床试验和动物实验来验证发现。尽管如此，该方法为探索中药治疗提供了新途径。

从临床转化角度看，延胡索的多靶点特性提供了有趣的可能性。除了开发延胡索衍生制剂作为独立疗法外，研究其与现有神经病理性疼痛药物（如普瑞巴林、度洛西汀）的潜在协同相互作用是一个有前景的方向。临床前探索这种组合的研究可能会发现提供增强疗效或减少常规药物剂量（从而减少副作用）的方案。最终，推进这些发现需要重点研究活性延胡索组分的药代动力学、生物利用度（可能解决生物碱吸收挑战）和全面安全性特征。从计算预测（in silico）到实验验证（in vitro和in vivo）最后到临床探索的进展，代表了实现像延胡索这样的多靶点草药方法在解决NP患者未满足需求方面的潜力的关键途径。