FLT3与Hedgehog通路协同抑制下AML细胞外囊泡蛋白分选机制及通路扰动研究

本研究发现FLT3抑制剂Crenolanib（Creno）与Hedgehog通路抑制剂HPI-1在急性髓系白血病（AML）细胞系中具有协同抑制作用，并通过深度蛋白质组学分析揭示了单药及联合用药对细胞及细胞外囊泡（EVs）蛋白质组的显著影响。研究首次证实Creno治疗可选择性抑制核糖体蛋白（如RPS26、RPL27A）和ErbB通路成员（如GAB1、GRB2、SHC1）向EVs的转运，这一发现在AML患者来源EVs的对比蛋白质组学中得到验证。该工作为理解EVs在微环境调控中的作用及靶向治疗策略提供了新视角。

　　

协同抑制FLT3与Hedgehog通路对AML细胞外囊泡蛋白分选及通路扰动的影响

3.1 Crenolanib与HPI-1联合治疗协同抑制AML细胞代谢与增殖

研究通过alamarBlue代谢活性检测发现，FLT3-ITD突变的AML细胞系MOLM-14和MV4-11对FLT3抑制剂Crenolanib（Creno）和Hedgehog通路抑制剂HPI-1呈现剂量与时间依赖性的代谢抑制效应。值得注意的是，SMO抑制剂Glasdegib（Glas）未显现显著抑制作用，提示非经典Hedgehog信号通路可能参与耐药机制。通过零相互作用效能（ZIP）模型分析，低浓度Creno（1-50 nM）与HPI-1（10-1000 μM）联合使用表现出显著协同效应，且在经切向流过滤（TFF）去除血清源性EVs的培养基中协同作用更为突出。进一步通过流式细胞术验证，Creno单药可剂量依赖性地降低细胞活力和增殖，而HPI-1主要影响增殖，联合治疗（10 nM Creno + 50 nM HPI-1）在抑制增殖方面展现最强效果。

3.2 联合通路抑制后的蛋白质组学揭示细胞代谢重编程

采用TMT标记的高分辨率质谱技术，对经48小时处理的MOLM-14细胞进行定量蛋白质组学分析，共鉴定到5520个蛋白质。主成分分析（PCA）显示不同处理组蛋白质表达谱显著分离，其中Creno单药与联合治疗组聚类紧密。基因集富集分析（FGSEA）表明，Creno及联合治疗显著上调氧化磷酸化（OXPHOS）、三羧酸循环及支链氨基酸降解等能量代谢通路，同时下调DNA复制相关通路。HPI-1单药则主要抑制核糖体生物合成。联合治疗特异性调控脂质代谢相关蛋白（如APOC3、FADS2）及线粒体功能蛋白（如NDUFB1、SQOR），提示代谢适应性重编程在协同效应中的关键作用。

3.3 细胞、EVs与条件培养基蛋白质组比较揭示差异蛋白分选

通过比较对照组细胞、EVs及条件培养基（CM）的蛋白质组，发现三者具有显著异质性。EVs中经典标志物（CD9、CD63、ALIX、TSG101）显著富集，而CM中血清蛋白（如白蛋白、维生素D结合蛋白）占主导。进一步分析发现，EVs中特有605个蛋白质，其中细胞外基质（ECM）受体相互作用和黏着斑通路相关蛋白（如整合素、层粘连蛋白）选择性富集，提示EVs在介导细胞-微环境通讯中的主动分选机制。

3.4 通路抑制后EV蛋白质组呈现特异性改变

对四种处理条件下（DMSO对照、100 nM Creno、2000 nM HPI-1及10 nM Creno + 50 nM HPI-1）的EVs进行深度蛋白质组学分析，鉴定到3476个蛋白质。PCA显示处理组间明显分离，Creno单药与联合治疗组EV蛋白质组高度相似。通路分析表明，Creno及联合治疗下调促增殖信号通路（如ErbB、JAK-STAT），而上调剪接体和蛋白酶体通路。值得注意的是，所有处理均导致EVs中OXPHOS蛋白下调，与细胞蛋白质组中的上调趋势相反，反映能量代谢蛋白的分泌抑制。

3.5 细胞与EV蛋白质组比较揭示治疗特异性分选模式

通过对比细胞与EVs中显著差异表达蛋白，发现核糖体蛋白在细胞层面无显著变化，但在EVs中经Creno或HPI-1处理后显著下调。更为重要的是，ErbB信号通路关键分子（如GRB2、GAB1、SHC1）在EVs中经Creno及联合治疗后明显下调，而细胞中表达稳定。KEGG通路可视化显示，MAPK与PI3K-Akt信号轴是主要受影响分支。此外，AML细胞系EVs与非AML来源EVs的重新分析证实，核糖体蛋白及ErbB通路成分在AML中普遍上调，提示其作为潜在致癌因子。

3.6 高风险AML患者EV蛋白质组验证临床相关性

对5例高风险AML患者和4例健康 donor 血浆来源EVs进行蛋白质组学分析，PCA显示患者与对照组显著分离。患者EVs中核糖体蛋白及ErbB/FLT3通路成分普遍上调，与细胞系模型发现一致。通路富集分析进一步证实，核糖体、PI3K-Akt及Rap1信号通路在患者EVs中激活，而代谢通路下调，支持AML EVs在疾病进展中的功能性作用。

4 讨论

本研究系统阐明了Creno与HPI-1在AML中的协同抑制效应，并通过多维度蛋白质组学揭示了EV蛋白质分选的治疗特异性调控。研究发现，Creno驱动细胞代谢向OXPHOS依赖转变，而联合治疗通过调控脂质代谢增强这一效应。尤为重要的是，研究首次发现Creno选择性抑制核糖体蛋白及ErbB通路成员向EVs的转运，这一现象在患者样本中得到验证。与既往报道中化疗诱导EVs促肿瘤特性不同，本研究提示Creno可能通过改变EV cargo抑制微环境中的促癌信号传递。ErbB信号在AML中的激活及EV介导的传递为联合靶向治疗提供了新思路。未来研究需进一步功能验证EVs在耐药传递、免疫调控及微环境重塑中的作用。

5 结论

本研究证实FLT3与Hedgehog通路协同抑制可重塑AML细胞及EVs的蛋白质组格局，其中Creno介导的核糖体蛋白及ErbB信号分子向EVs的分泌抑制可能是其治疗作用的新机制。该发现为AML靶向治疗及EV-based生物标志物开发提供了重要理论依据。