血清细胞外囊泡携带Trop2蛋白作为前列腺癌潜在分子标志物的研究

本研究创新性地结合ExoTIC分离技术与ELISA检测，首次在前列腺癌患者血清中量化细胞外囊泡表面Trop2蛋白（EV-Trop2）表达水平，发现其在高危组、低危组和无癌组间存在显著差异（p<0.0001），为前列腺癌无创诊断和风险分层提供了新型分子标志物。

引言

组织活检和成像是癌症诊断的核心手段，但存在侵入性操作、患者不适和辐射暴露等问题。液体活检分析因其微创特性、实时监测能力和增强的基因组学与蛋白质组学分辨率而备受关注。细胞外囊泡和颗粒（EVPs）作为细胞间通讯载体，在临床样本中具有巨大的诊断潜力。

外泌体作为EVPs的一个亚类，是直径小于200纳米的脂质双层结构，源于内体膜的内向出芽。所有细胞类型都会释放外泌体，但由于生物发生机制的复杂性，当前标准分离技术在明确富集和表征EVPs方面存在局限。根据细胞外囊泡研究最小信息（MISEV）2023的建议，本研究采用通用术语"EVs"指代细胞外囊泡群体。

EVs存在于血液等临床样本中，与循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和其他循环RNA及蛋白质共存。虽然CTCs信息丰富但数量稀少，cfDNA半衰期短限制其可检测性，而EVs数量可达每毫升血浆10¹⁰-10¹²个。这些囊泡由包括癌细胞在内的多种细胞类型分泌，存在于血液、唾液、尿液和灌洗液等多种体液中，作为细胞间运输载体，携带RNA、DNA、蛋白质、脂质和代谢物等分子 cargo。

研究方法

EV-Trop2 ELISA方案的优化

使用DU145前列腺癌细胞系（ATCC, HTB-81）进行方案优化，该细胞系以高细胞Trop2水平而闻名。细胞在含10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素抗生素的RPMI-1640完全生长培养基中培养。达到80-90%融合度后，更换为无血清培养基进行48小时饥饿处理。

患者样本

评估了来自斯坦福泌尿外科组织和血清库的66份样本，分为三组：无癌组（21例经活检证实无前列腺癌的男性）、低风险前列腺癌组（23例根治性前列腺切除术后至少5年无生化复发的患者）和高风险前列腺癌组（22例前列腺切除术后复发的患者）。患者信息包括术前PSA水平和根治性前列腺切除标本中的Gleason评分（4+5级）百分比。

细胞外囊泡分离与分析

使用外泌体总分离芯片（ExoTIC）分离EVs，该方法包含50纳米聚碳酸酯纳米孔低蛋白结合滤膜、200纳米PES支撑膜和厚纤维素纸垫。100微升血清样本用PBS稀释后，通过0.22微米PES注射器过滤器，以5毫升/小时的恒定速率引入ExoTIC装置。50-220纳米大小的EVs被保留在分离室中，较小分子通过出口排出。分离后使用PBS进行彻底清洗，然后通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行分析。

Western Blot

使用RIPA缓冲液裂解EV样本，通过Laemmli缓冲液和2-巯基乙醇还原蛋白，95°C加热5分钟。样本加载到4-20% PAGE蛋白凝胶中，50V对齐后80V运行4小时。蛋白转移到PVDF膜上，与CD81、TSG101（阳性标志物）和Calnexin（阴性标志物）一抗孵育过夜，然后与HRP标记二抗孵育2小时，最后使用化学发光底物显影。

冷冻电子显微镜

在C-flat EM网格上制备EVs样本，通过辉光放电处理后在100%湿度和4°C条件下应用3微升EVs样本， blot 3秒后 plunge-frozen 到预冷液态乙烷中。使用Glacios Cryo-TEM系统获取图像。

EV-Trop2 ELISA

使用夹心ELISA法检测EV-Trop2水平。抗Trop2捕获抗体在包被缓冲液中稀释后4°C过夜包被ELISA板，用5% BSA封闭过夜。加入5微升EV样本室温孵育2小时，加入生物素化抗Trop2检测抗体孵育2小时，洗涤后加入链霉亲和素-HRP孵育30分钟，最后使用TMB底物显色20分钟，450nm测量吸光度。

数据处理与可视化

使用GraphPad Prism、Python-based Orange Data Mining软件和PlotsOfData网络应用进行数据分析和绘图。采用多种机器学习算法包括k近邻（kNN）、逻辑回归、神经网络、随机森林和支持向量机（SVM）进行多变量数据集建模，使用留一法交叉验证（LOOCV）生成接收者操作特征（ROC）曲线评估模型性能。

研究结果

临床样本血清来源EVs的表征

通过冷冻透射电镜观察，分离的EVs呈现典型的EV样结构：完整、圆形、具有脂质双层膜构型。NTA测量的EVs大小分布显示，各组平均和中值尺寸均小于200纳米。高风险PC样本的EV尺寸显著小于其他两组，这与先前报道的更具侵袭性癌症与较小EV尺寸相关的发现一致。

Western blot分析显示所有患者样本组中均存在EV蛋白标志物CD81和TSG101，而内质网蛋白污染物calnexin的阴性表达证实了该方法分离血清来源EVs的有效性。

EV-Trop2 ELISA方案的优化

使用DU145前列腺癌细胞系来源的EVs优化检测方案。通过NTA量化EV数量（2.19×10⁶±8.28×10⁴颗粒/毫升培养基/百万细胞）并评估尺寸分布。将健康人血浆样本与DU145细胞系分离的EVs spike-in，评估 assay 特异性并确定EV-Trop2 assay所需的最小EV样本体积。使用已知的DU145 EV浓度（1.9×10⁸颗粒/微升），确定 assay 在1.25-5微升EV样本间的线性范围。

EV-Trop2水平的测量

在发现队列（N=66）中，高风险PC组的EV-Trop2水平显著升高。高风险PC组与无癌组间（p<0.0001）、高风险PC组与低风险PC组间（p=0.0015）差异均具有统计学意义。EV-Trop2水平归一化至ELISA使用的5微升EV溶液中的EV数量（来自NTA读数），以考虑患者样本间EV数量的变异性。

Western blot分析与EV-Trop2 ELISA测量结果的一致性验证了ELISA平台的有效性：ELISA读数显示较高EV-Trop2水平时（如高风险PC），Western Blot化学发光结果也相应增加，证实了Trop2在EVs上的存在及其对ELISA所用抗体的可及性。

箱线图显示高风险PC组中位数（2.603×10^-9 pg/颗粒）显著高于无癌组（0.426×10^-9 pg/颗粒）和低风险PC组（0.752×10^-9 pg/颗粒）。虽然低风险和高风险PC组间存在一些重叠，但选择合适的EV-Trop2阈值改善了高风险PC患者的分类。

高风险PC患者中EV-Trop阈值的确定

根据美国泌尿外科协会（AUA）和前列腺癌基金会（PCF）的临床指南，PSA水平≥20纳克/毫升通常指示高风险前列腺癌，而PSA水平<10纳克/毫升属于低风险类别。仅看PSA水平，本研究队列中12例高风险PC患者因PSA水平低于20纳克/毫升而被错误分类。

有趣的是，这些患者的EV-Trop2水平升高。探索EV-Trop2在2×10^-9 pg/颗粒的阈值（>无癌组的90百分位和>低风险PC的75百分位）时，错误分类的高风险PC患者数量减少了50%（现仅6例）。这些结果表明，EVs表面蛋白分析（如Trop2量化）可能提供PSA alone无法捕获的疾病侵袭性分子洞察。

EV-Trop2表达与PSA水平关联分析以检测高风险PC患者

比较EV-Trop2水平与PSA测量值，患者分布在EV-Trop2和PSA水平双轴矩阵中显示四个象限。大多数高风险PC患者聚集在第2和第4象限，表明高EV-Trop2水平与高风险PC相关，无论PSA水平如何。

第4象限特别强调了EV-Trop2分析的相关性：几名PSA水平低于20纳克/毫升的高风险患者（本应属于低风险类别）表现出高EV-Trop2水平，在分子水平上与更具侵袭性疾病一致。这表明EVs可能携带PSA alone无法捕获的肿瘤相关信息。

第3象限中PSA和EV-Trop2水平均低，由于无癌组PSA水平意外升高（>5纳克/毫升，超过推荐指南<4纳克/毫升），使得低风险PC和无癌组区分复杂化。三名高风险PC患者表现出高PSA但低EV-Trop2水平，落入第3象限，表明并非所有肿瘤相关EV群体都在其表面显示Trop2。

第1象限中三名高风险PC患者未被EV-Trop2分析检测到，这可能由于EVs上Trop2的选择性：特异性靶向某些肿瘤相关EV群体，但可能未捕获与前列腺癌相关的所有EV类型。

整合EV-Trop2分析与PSA增强多变量模型中的患者风险分层

采用多种算法（kNN、逻辑回归、神经网络、随机森林和SVM）评估将EV-Trop2与PSA测量结合如何为前列腺癌分层计算模型提供信息。所有算法在结合EV-Trop2和PSA时均显示出比单独使用PSA更好的分类器指标性能，神经网络表现最佳。

在患者分层模型中，结合EV-Trop2和PSA显示出比单独使用PSA模型更高的敏感性、特异性和准确性。单独使用PSA准确分类78.8%的高风险PC患者（特异性86.4%），而结合EV-Trop2和PSA时，准确性增至84.8%，特异性提高至90.9%。所有三组的阳性预测值（PPV）均改善至少10%。

错误分析重点关注两个最常见错误分类：低风险PC（LR）与无癌（CF）组间以及高风险PC（HR）与低风险PC（LR）组间。在单独PSA模型中，HR患者当PSA水平低于14纳克/毫升时被错误分类为LR，而LR患者当PSA超过此水平时被错误分类为HR，突出了PSA alone的局限性。

相比之下，结合EV-Trop2+PSA模型将HR错误分类为LR的数量从7例（仅PSA）减少到4例（EV-Trop2+PSA）。这些HR错误分类发生在EV-Trop2水平检测较低时（2×10^-9 pg/颗粒）。相反，几个LR样本当其EV-Trop2水平超过相同阈值时被错误分类为HR。这些案例中的PSA水平未显示清晰趋势，表明EV-Trop2可能提供超越PSA浓度的额外分子背景。

讨论

在这项发现队列研究中，我们观察到血清来源EV-Trop2水平在前列腺癌风险组间的 distinct 模式，高风险PC病例中的水平升高。一些具有低PSA但高EV-Trop2水平的高风险PC患者表明，EV-Trop2可能提供补充PSA的分子洞察， potentially 改善可能被忽视的高风险PC患者的识别，尽管本研究的有限患者队列需要进一步调查。

在多变量分析中，当EV-Trop2与PSA测量结合时，模型在识别经历术后复发的临床显著高风险PC患者方面显示出比单独使用PSA更好的分类器指标。这些发现令人鼓舞，但仍是初步的，需要更大队列的进一步验证以确认这种EV分析方法的潜在分析效用和更广泛解释价值。

与组织-based 遗传测试（如Decipher、Oncotype Dx Prostate、Prolaris）提供活检样本预后洞察相比，我们的方法专注于血清中的EV-Trop2，提供了一种微创方式来研究癌症相关的细胞外通讯动力学。ExoDx前列腺测试作为一种商业可用的无创尿液测试，测量外泌体RNA水平（ERG、PCA3和SPDEF）以评估高级别前列腺癌风险，主要针对PSA水平在2-10纳克/毫升之间且考虑初始活检的患者。相比之下，我们的assay采用简单ELISA检测血清来源EVs上的Trop2蛋白，实现蛋白质水平分析作为PSA的补充分子指标。

展望

我们的愿景是使用这种方法作为微创工具来改善患者风险分层，这可能显著影响治疗决策，如监测、放疗或前列腺切除术，以及在早期阶段检测复发。这种方法对于调查接受前列腺癌筛查的个体、诊断后处于监测下的个体或治疗后正在监测的个体间的分子异质性可能有价值。通过评估循环EVs表面Trop2表达，我们的方法提供了一种表征肿瘤相关分泌谱的手段，在建模疾病进展和复发方面具有潜在应用。

超越前列腺癌风险分类，血液中EV-Trop2水平的评估可能与理解目前处于临床评估中的Trop2靶向治疗（NCT03725761）的反应模式相关。目前，Trodelvy（一种靶向Trop2的抗体-药物 conjugate）已获得FDA批准用于治疗多种癌症，包括三阴性乳腺癌、激素阳性乳腺癌和尿路上皮癌。然而，缺乏快速微创工具来监测对Trop2靶向治疗的反应。本研究中引入的EV-based工作流程可能为在一系列上皮癌中分析囊泡结合Trop2蛋白提供一个起点，尽管需要进一步工作来定义其特异性、动力学和转化潜力。