多效应因子协同触发美洲龙葵（Solanum americanum）对丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的非寄主抗性机制研究

本研究系统揭示了模式病原细菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pto DC3000）的多个III型效应因子（包括AvrPto、HopAD1、HopAM1、HopC1、HopAA1-1、HopM1和AvrE1）在野生茄科植物Solanum americanum中触发超敏反应（HR）并介导非寄主抗性（NHR）的分子机制。通过构建系列效应因子缺失突变体，证实这些效应因子在细菌致病性与植物免疫识别中的双重功能，尤其保守效应因子HopM1和AvrE1对病原菌毒力至关重要。该研究为茄科作物抗病育种提供了潜在靶点，并为理解多效应因子触发的ETI（effector-triggered immunity）在NHR中的作用提供了新见解。

　　

引言

植物在自然界中持续面临病原菌侵袭，但病害发生并不常见，这主要归因于其 evolved 的多层免疫机制。植物免疫主要包括两个层面：模式触发免疫（PTI）和效应因子触发免疫（ETI）。PTI通过细胞表面的模式识别受体（PRR）识别病原菌相关分子模式（PAMP），而许多病原菌则通过III型分泌系统（T3SS）递送效应蛋白来抑制PTI。作为反击，植物进化出ETI，通过NLR蛋白识别特定效应因子，并常引发超敏反应（HR），导致侵染部位局部细胞死亡。

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pto DC3000）是研究植物-微生物相互作用的模式细菌病原体，其III型效应因子的分泌和功能已被广泛研究。Pto DC3000分泌多种功能复杂且冗余的效应因子，为研究单个效应因子功能带来挑战。为此，研究人员在Pto DC3000背景中构建了多效应因子缺失突变体，如缺失18个成簇高表达效应因子的D18E、缺失28个高表达效应因子的D28E、以及进一步缺失弱表达效应因子hopAD1的D29E，最终获得缺失所有36个已知效应因子的D36E。这些多突变体在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中表现出毒力显著降低。

野生植物物种是抗性基因的宝贵来源。近年来，野生茄科物种Solanum americanum因其高质量基因组组装和NLR基因库的解析，成为鉴定抗性基因的理想模型。例如，从S. americanum中已克隆出识别Phytophthora infestans效应因子的NLR基因，如Rpi-amr1和Rpi-amr3，这些基因在其他茄科作物中也能提供抗性。

结果

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000在Solanum americanum中触发III型分泌系统依赖性抗性

为探究S. americanum对P. syringae的抗性遗传基础，研究人员将Pto DC3000（OD_600nm=0.1）浸润到28个S. americanum种质叶片中，测试超敏反应（HR）的发生。与Phytophthora infestans和Ralstonia pseudosolanacearum不同（它们仅在部分种质中诱导抗性），Pto DC3000野生型菌株在所有测试种质中均触发强烈HR。

通过测试Pto DC3000多突变体（D18E、D29E和D36E）在S. americanum种质SP2273中的HR诱导能力，发现野生型和D18E触发强HR，而D29E和D36E未诱导任何可见症状。此外，这些菌株在SP2273中均未显示生长，表明多效应因子缺失不仅导致HR丧失，也导致细菌毒力丧失。但野生型相比D36E表现出略高的菌株生长，提示携带效应因子可增强毒力，即使ETI被激活。

基于这些结果，研究人员假设D18E中存在而D29E中缺失的11个效应因子（HopA1、HopAD1、HopAF1、HopAM1、HopB1、HopE1、AvrPto、AvrPtoB、HopI1、HopK1和HopY1）是主要的无毒力效应因子候选者。此外，野生型中存在而D18E中缺失的18个效应因子（HopAA1-1、HopAA1-2、HopAO1、AvrE1、HopC1、HopD1、HopR1、HopG1、HopH1、HopM1、HopN1、HopO1-1、HopQ1-1、HopF2、HopT1-1、HopU1、HopV1和HopX1）也可能是额外的无毒力效应因子候选者。D29E中剩余的7个效应因子（HopS2、HopO1-3'、HopO1-2、HopS1'、HopBM1、HopT2和HopT1-2'）被排除，因D29E未能触发HR，且这些基因被认为是弱表达基因或假基因。

AvrPto、HopAM1或HopAD1在Solanum americanum中触发超敏反应

为鉴定在S. americanum中触发防御反应的无毒力效应因子，研究人员通过农杆菌介导的瞬时转化（agroinfiltration）在SP2273叶片中瞬时表达上述11个效应因子。发现HopAD1、HopAM1或AvrPto的浸润均引发强烈HR。为排除其他效应因子因蛋白不稳定而未触发HR的可能性，这些效应因子在本氏烟中瞬时表达并通过免疫印迹检测，所有效应因子均显示可检测的蛋白表达水平。尽管HopAM1表达较弱，但仍能诱导HR，表明其表达水平足以激活植物防御反应。

缺失avrPto、hopAM1和hopAD1的Pto DC3000在Solanum americanum中显示增强的菌株生长但仍触发超敏反应

为探究AvrPto、HopAM1和HopAD1在Pto DC3000毒力中的作用，研究人员依次删除这些效应因子基因，并测试它们在S. americanum中的HR诱导和菌株生长能力。通过使用修饰的自杀载体pK18mobsacB-GG构建效应因子敲除突变体。

首先从野生型中删除avrPto，获得菌株PKSG 4673。由于hopAM1基因存在两个相同拷贝（染色体上的hopAM1-1和质粒pDC3000A上的hopAM1-2），随后从PKSG 4673中删除hopAM1-1（PKSG 7065），再从中删除hopAM1-2（PKSG 7903），最后删除hopAD1，获得PKSG 7377。

通过浸润低浓度菌悬液（OD_600nm=0.0001）到SP2273叶片中测量菌株生长，发现所有突变体菌株（PKSG 4673、PKSG 7065、PKSG 7903和PKSG 7377）均显示比野生型显著更高的菌株生长，但突变体之间无显著差异。通过浸润高浓度菌液（OD_600nm=0.1）测试HR诱导能力，发现所有四种突变体仍触发强HR。这些结果表明AvrPto、HopAM1和HopAD1显著贡献于Pto DC3000在S. americanum中的无毒力，但剩余的HR提示可能存在额外的无毒力决定因子。

HopC1、HopAA1-1、HopM1或AvrE1的瞬时表达在Solanum americanum中触发超敏反应

为鉴定额外的无毒力效应因子，研究人员测试了野生型中存在而D18E中缺失的18个次级候选效应因子（HopAA1-1、HopAA1-2、HopAO1、AvrE1、HopC1、HopD1、HopR1、HopG1、HopH1、HopM1、HopN1、HopO1-1、HopQ1-1、HopF2、HopT1-1、HopU1、HopV1和HopX1）在SP2273中的HR诱导活性。发现HopAA1-1、AvrE1、HopC1或HopM1的农杆菌浸润在3 dpi时诱导强HR。免疫印迹分析证实这些效应因子均有可检测的表达水平。

HopM1和AvrE1在细菌毒力和病害症状发展中起关键作用

为测试HopC1、HopAA1-1、HopM1和AvrE1在HR诱导和细菌毒力中的作用，研究人员构建了额外的效应因子敲除突变体。由于HopM1和AvrE1分别需要伴侣蛋白ShcM和ShcE以实现功能，因此删除效应因子基因的同时删除其伴侣基因。

首先在PKSG 7377中删除hopC1，获得ΔavrPto hopAM1-1 hopAM1-2 hopAD1 hopC1（PKSG 7768）。随后在PKSG 7768中删除hopAA1-1，获得PKSG 7826。进一步删除shcM-hopM1或/和shcE-avrE1，获得三个额外敲除菌株（PKSG 7899、PKSG 7900和PKSG 7892）。

通过菌株生长试验，发现PKSG 7768、PKSG 7826和PKSG 7899突变体显示比野生型显著更高的菌株生长，但缺失shcE-avrE1的PKSG 7900和PKSG 7892的菌株生长与野生型无显著差异。HR诱导试验显示PKSG 7768、PKSG 7826、PKSG 7899和PKSG 7900触发显著减弱的HR，而缺失所有HR触发效应因子的PKSG 7892完全消除HR。

通过额外接种试验监测病害症状，发现当用低浓度菌液（OD_600nm=0.00001）浸润SP2273叶片时，PKSG 7826相比PKSG 7377和PKSG 7768引起更严重的细菌性斑点症状，尽管菌株生长相当。通过浸渍接种（OD_600nm=0.001）进一步证实表型，PKSG 7826在SP2273中引起轻度细菌性斑点症状，而野生型在相同条件下未引起可见病害症状。

这些结果表明HopC1、HopAA1-1、HopM1和AvrE1是Pto DC3000在S. americanum中无毒力所必需的。此外，尽管具有HR诱导活性，HopM1和AvrE1似乎具有强毒力功能，因为删除这些效应因子显著降低菌株生长。

无毒力效应因子在多个Pseudomonas syringae菌株中的保守性

为调查本研究中鉴定的七个无毒力效应因子的保守性，研究人员分析了117个具有可用基因组序列的植物病原Pseudomonas菌株中的存在/缺失多态性，使用PsyTEC库中的效应因子参考序列。根据设定标准（E值高于1e^?24或序列覆盖度低于60%视为缺失），HopAD1、HopAM1、AvrPto、HopC1、HopAA1、HopM1和AvrE1分别在117个菌株中的8个（6.8%）、25个（21.4%）、34个（29.1%）、14个（12%）、70个（59.8%）、75个（64.1%）和109个（93.2%）中存在。

讨论

多效应因子触发的植物免疫参与非寄主抗性

与Phytophthora infestans和Ralstonia pseudosolanacearum不同，Pto DC3000在所有测试S. americanum种质中诱导防御反应，且保守P. syringae效应因子如HopAA1-1、HopM1和AvrE1在S. americanum中激活防御反应，表明S. americanum可能是P. syringae的非寄主植物物种。

非寄主抗性是一种由非适应病原菌引发的持久植物免疫响应。其分子基础尚未完全清楚，认为涉及多个贡献因素。一种 proposed 机制是NLR基因识别病原菌效应因子。例如，Phytophthora sojae通常是非适应病原菌，但删除效应因子AvrNb（被免疫受体NbPrf识别）使P. sojae能够感染本氏烟，凸显了ETI在非寄主抗性中的作用。

与本 results 一致，先前研究表明非寄主抗性可通过识别多个病原菌效应因子介导。例如，在拟南芥中，非寄主抗性是多基因的，通过识别多个Albugo candida效应因子诱导。同样，辣椒中的研究支持这一概念，多个RxLR效应因子从Phytophthora infestans中鉴定，在 diverse 辣椒种质中触发HR，表明多效应因子识别贡献于非寄主抗性。

本研究从病原菌角度提供额外证据，表明删除多个HR触发效应因子使先前非致病菌株能够在S. americanum中引起病害。单独删除avrPto增强菌株生长但未引起病害症状，而删除额外HR触发效应因子（hopAM1-1、hopAM1-2、hopAD1、hopC1和hopAA1-1）的PKSG 7826诱导病害症状，尽管菌株生长相当。这表明剩余效应因子可能激活较弱免疫响应，在菌株生长试验中未明显显示。由HopAM1-1、HopAM1-2、HopAD1、HopC1和HopAA1-1激活的弱免疫可能阻止AvrE1和HopM1完全贡献于症状发展，表明多效应因子可参与非寄主抗性。因此，本研究支持多ETIs是非寄主抗性遗传基础之一的观点。

HopM1和AvrE1在Pseudomonas菌株中高度保守且在Solanum americanum中毒力关键

本研究表明HopM1和AvrE1对Pto DC3000在S. americanum中的完全毒力至关重要。先前多项研究显示HopM1和AvrE1在病原菌毒力中的重要性。例如，在Pto DC3000中删除hopM1和avrE1降低在番茄中的生长和病斑形成。在P. syringae pv. actinidae中，尽管HopM1因schM功能丧失突变而非功能性，AvrE1显著贡献于在猕猴桃中的毒力。此外，AvrE家族成员DspA/E和WtsE分别对Erwinia amylovora和Pantoea stewartii的完全毒力至关重要。最近，AvrE1和HopM1显示对菠菜中细菌毒力关键。

有趣的是，HopM1和AvrE1显示在细菌侵染期间对水浸症状发展关键。HopM1和AvrE1通过激活脱落酸（ABA）信号诱导气孔关闭，在质外体产生有利于细菌增殖的水环境。与这些发现一致，本研究结果支持HopM1和AvrE1在S. americanum中的毒力功能。

可以想见，Pto DC3000中的其他效应因子抑制HopM1和AvrE1在S. americanum中的无毒力活性。研究表明由保守效应因子如HopAA1、HopM1和AvrE1介导的免疫响应可被其他效应因子功能抑制。例如，HopI1抑制AvrE1、HopM1、HopQ1-1、HopR1或HopAM1在本氏烟中触发的细胞死亡。因此，这表明这些HopM1和AvrE1可能对Pto DC3000的完全毒力不可或缺，尽管它们有被S. americanum中未知植物免疫受体识别的 disadvantage。

尽管HopM1和AvrE1被描述具有功能冗余，本研究结果显示删除任一效应因子导致在S. americanum中的细菌生长减少。这种差异可能反映宿主抗性基因库差异或其他删除效应因子可能影响不同水平的冗余。

识别识别HR触发效应因子的NLR基因可能使我们能够开发持久抗细菌性斑点病的茄科作物

非寄主抗性提供对病原菌的广谱持久抗性。本研究假设S. americanum中的非寄主抗性由多ETIs介导。因此，识别参与非寄主抗性的效应因子的NLR基因可能为开发茄科作物中对P. syringae的持久抗性提供工具。

本研究中鉴定的 several 无毒力效应因子也在其他植物物种中触发免疫响应。例如，HopAD1在本氏烟中诱导免疫相关细胞死亡。AvrPto已知结合Pto激酶，在番茄中激活Prf依赖性抗病性。在S. americanum SP2273基因组中，存在Prf同源基因（sp2273chr05_g00758）。

尽管 several 效应因子在SP2273中触发细胞死亡，单独从Pto DC3000野生型中删除avrPto显著增强菌株生长。这些观察可能提示SP2273 Prf同源基因是