柔性变构环调控蛋白质活性与静电重连机制研究

《Protein Science》：A flexible, allosteric loop regulates protein activity and rewires electrostatics

本综述深入探讨了柔性变构环（loop 11–12）在分支酸变位酶（CM）中的关键调控作用。通过先进的NMR技术（如PRE和sPRE）与分子动力学（MD）模拟，揭示了该环通过动态构象采样与静电重塑（electrostatic remodeling）机制，实现远距离变构调控（allosteric regulation）的新范式，为理解蛋白质功能调控提供了新视角。

1 引言

变构调控（Allostery）是生物系统中蛋白质功能与行为的关键驱动因素。传统上，变构调控主要归因于构象变化和动态变化，且多源于蛋白质的结构化区域。虽然特定非结构化元件（如活性位点附近的催化环）的调控作用已被广泛表征，但远端柔性环的作用仍知之甚少。本研究以分支酸变位酶（Chorismate Mutase, CM）为模型，该酶是芳香族氨基酸生物合成途径中的关键同源二聚体酶。CM的活性受到色氨酸（Trp，激活剂）和酪氨酸（Tyr，抑制剂）的差异调控，二者结合位点距离活性位点超过25 ?。尽管TrpCM和TyrCM的NMR谱几乎相同，但其功能景观却显著不同，暗示存在替代机制。研究表明，位于远离活性位点的结构不可见且高度灵活的环（loop 11–12）中的单个突变能 drastically 改变CM的活性景观。利用环的顺磁标记，发现loop 11–12会向活性位点发生瞬时偏移，但仅在激活剂Trp存在时发生。此外，采用一种新颖的NMR方法，揭示了loop 11–12调控CM的静电特性，可能通过影响电荷分布为酶活性提供另一种控制。这些发现支持了一个复杂的变构过程，其中一個柔性的、远端的环在功能上与效应子结合区域和活性位点耦合。这一机制为理解蛋白质实现变构调控的多样化方式提供了新的见解，并可能有助于理解其他变构系统中的柔性区域。

2 结果

2.1 柔性远端环内的单点突变调控CM活性

Loop 11–12（残基212–226）在CM中先前被认为可能与酶的活性位点“连接”，尽管其在结构上整体是分离的。由于环的大部分区域缺乏电子密度，其灵活性程度尚未很好表征。NMR光谱显示，在apo和TrpCM状态下，对应于loop 11–12的超过一半的信号消失，表明该环存在显著的信号线宽 broadening，源于动力学或构象分布。特别地，位于环N端片段（残基214–220）的信号在两种状态的HSQC谱中均缺失。先前研究通过MD模拟分析提出，该N端区域的D215可能促进loop 11–12与活性位点区域之间的极性接触。考虑到该环明显的灵活性及其假定的与活性位点结构通信的作用，我们旨在研究loop 11–12中的特定残基是否对蛋白质功能的调控有贡献。

为了确定loop 11–12中单个残基对CM功能的作用，我们评估了D215A CM突变体的酶活性。即使在激活剂色氨酸存在下，也观察到CM活性的显著丧失，表现为底物结合亲和力的明显降低。有趣的是，这种D215的抑制效应是pH依赖性的：在pH 7.5时，TrpCM^D215A的活性急剧降低，而在pH 6.5时，其活性恢复到野生型水平。此外，与野生型酶的双曲线动力学不同，pH 7.5下的TrpCM^D215A显示出S形曲线。这种从双曲线到S形活性曲线的转变表明，D215A突变引入了一种协同效应，尽管底物结合降低，但这可能作为一种补偿机制。这种效应是D215A独有的，因为在环中部附近另一个带电荷残基的类似突变（E219A）并不影响底物亲和力或活性曲线形状。D215A对蛋白质活性的抑制表明，loop 11–12作为一个变构调控元件发挥作用，这对于蛋白质的远端柔性环而言是一个不常见的特征。此外，该效应的pH可逆性暗示了一种机制途径，即CM通过调控蛋白质关键区域的离子环境来维持其催化特性。

2.2 环11–12的调控作用并非基于全局构象变化或转换动力学

经典的变构模型认为，蛋白质通过构象变化来调整其活性水平。因此，蛋白质在其活性较低时采用“紧张”（T-state）构象，而在其活性较高时采用“松弛”（R-state）构象。我们先前使用甲基NMR光谱的研究揭示了CM的T态和R态之间存在明显且易于识别的峰位差异。为了评估D215A是否引起了可能导致CM活性差异的蛋白质结构变化，我们收集了ILV ¹H-¹³C HMQC光谱，并在pH 6.5和7.5下监测化学位移扰动（CSPs）。结果显示，在距离loop 11–12较远的残基上，TrpCM^D215A与TrpCM相比，在任一pH下均未出现显著的CSPs。唯一显著的CSPs发生在残基L205、V211、V214、I225、L230和I233，它们位于loop 11–12的N端和C端附近，由于靠近突变位点，出现差异是预期的。尽管D215A突变在pH 7.5下抑制了CM的活性，但它并未引起重大的构象变化，蛋白质主要仍保持其基态T构象。TrpCM^D215A和TrpCM在pH 7.5下微小的结构差异意味着TrpCM^D215A的变构抑制机制更为复杂，不能归因于构象变化。总体而言，CM的结构特征与活性并不相关。

我们最近表明，虽然TrpCM主要采用T构象，但它会动态地采样R构象。尽管TrpCM中R态的群体占比不到10%，但动态地excursion进入R态可能构成其高催化活性的基础。为了测试TrpCM^D215A的行为是否受这种构象转换动力学的支配，我们采用¹H Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) NMR实验来评估TrpCM^D215A相对于TrpCM的动态谱。结果显示，D215A突变淬灭了几乎整个蛋白质的构象交换。引人注目的是，这种动力学抑制在pH 6.5下的TrpCM^D215A中也被观察到，而此时蛋白质的活性与野生型形式非常相似。虽然我们先前确定野生型TrpCM中的一大组残基以k_ex = 670 s^?1的速率进行协同的T到R构象交换，但对TrpCM^D215A进行全局拟合的尝试未成功，因为弛豫 dispersion 曲线的振幅太小，无法得到可靠的拟合。这与TrpCM^D215A中大多数残基表现出淬灭的动力学一致，表明构象交换的丧失。效应子结合区域（EBR, 残基42–104）是唯一显示显著转换的区域，它表现出更复杂的动态 repertoire，偏离了简单的两态构象交换。D215A诱导的动力学淬灭效应同时维持其酶功能，表明动态的、两态构象转换模型也与CM的活性变化不一致。

2.3 环11–12的动力学受CM效应子的差异偏置

解释柔性环loop 11–12的突变如何改变CM功能是具有挑战性的。单结构视图 fails，因为D215A似乎距离活性位点至少10 ?或更远，如晶体结构所示。添加另一个状态（两结构视图）以实现从非活性到活性的机制也 fails，如前一节所述。出于这些原因，我们考虑loop 11–12可能通过特定的瞬时偏移（transient excursions）来影响活性位点，从而控制CM活性。为了理解这可能如何发生，关于环构象采样的一般位置信息应具有高度价值。鉴于我们无法直接监测loop 11–12（由于NMR光谱中信号的缺失），我们在环内放置了一个顺磁弛豫增强（PRE）探针，作为追踪蛋白质中靠近loop 11–12区域的代理，从而有效 mapping 其空间定位。

PRE方法在阐明大分子行为的各个方面发挥了重要作用，从检测低群体构象到获得 intrinsically disordered proteins 的结构 insights。将氮氧自由基自旋标记（nitroxide spin label）置于loop 11–12的中间位置（参见第4节）允许检测蛋白质附近NMR可见位点的PRE效应。由于氮氧探针的PRE效应在最大25 ?范围内可被观察到，我们利用PRE诱导的峰强度损失来追踪具有不同活性的CM状态下的loop 11–12定位。

基本的PRE效应是顺磁自旋标记加速正常NMR峰信号的弛豫，当与自旋标记的距离足够近时，减少2D NMR光谱中的峰强度。使用¹H-¹³C TROSY HMQC光谱在侧链甲基位点观察PREs，该技术具有高灵敏度且能覆盖更多蛋白质区域，因为大多数CM甲基信号已被指认。重要的是，对CM的三种不同变构状态（根据结合的效应子：apo、Trp和Tyr）测量了PREs。总体而言，在所有状态下观察到的PREs可以粗略地分为两组。第1组包含靠近位置220自旋标记的残基，因此在结构上邻近loop 11–12。这包括环的残端（stubs）处的残基（V211、V214和I225），但也包括环边缘附近的一个簇：I128、I129、L230、V231和I233。该簇的位置与基态T态中的环定位一致，而不是R态，在R态中环的残端指向远离该簇的方向。确实，apoCM、TrpCM和TyrCM显示出的NMR光谱与T态一致。第2组PREs包含落在此近端范围之外的残基，因此可能源于环的动态偏移（dynamic loop excursions）。它们是L12、V20、I31、V120、V197和I237。它们主要位于二聚体的外部“尖端”，远离二聚体界面（V20除外），距离loop 11–12中的残基>20 ?。更具体地说，这些残基中的许多位于底物结合位点附近，表明loop 11–12可以从其“家”位置重新定位到CM活性位点的暴露表面。这个远端PRE组只能通过loop 11–12发生显著且可能是瞬时的重新定位 across CM的蛋白质表面来解释。

理解loop 11–12灵活性及其对CM功能影响的一个主要目标是，它是否受到变构效应子Trp和Tyr的调制。尽管激活剂Trp和抑制剂Tyr共享同一个结合位点，距离loop 11–12的边缘超过20 ?，但它们诱导了明显不同的环构象。差异（ΔI）根据列表化的PREs计算得出，正值（ΔI > 0）表示TrpCM的PRE更高，负值（ΔI < 0）表示TyrCM的PRE更高。即使不清楚loop 11–12究竟在何处以及如何采样各种位置，ΔI PREs明确显示了行为的变化。最显著和最大的正PRE差异（ΔI > 0）出现在活性位点的表观入口处，即V20和V197，在TrpCM中PRE强度比率高出约2.5倍。对于TyrCM和TrpCM的PRE效应也使用了两时间点速率计算 approach 进行了评估。对于V197，基于其他可以量化的峰，我们估计TrpCM的Γ?下限为49 s^?1。对于TyrCM，我们能够量化大多数PRE速率，V197的Γ?确定为25 ± 6 s^?1。鉴于TrpCM的V197 Γ?大约是TyrCM的两倍，且标准偏差相当，这突出了两种构建体在该蛋白质区域PRE效应的显著差异，证实了HMQC峰的ΔI观察结果。因此，相对于Tyr，激活剂Trp的结合使loop 11–12偏向于活性位点表面，显示在催化结构域的“下侧”。其他具有正ΔI值的位点是I129、I31和V211，后两个在TrpCM中显示信号 bleaching（完全消失），而在TyrCM中仅显示 modest PREs。相比之下，Tyr的结合导致在蛋白质另一个不同区域的更大PREs（ΔI < 0）。这些差异都不如V20和V197的差异大，但它们形成了一个残基簇，包括I103、V111、I237、I241和V254，其中I103的位置略微分离。正如在数据中所见并映射到结构上，这种Tyr驱动的loop 11–12偏好接近这个上表面是 modest 的，但它 clearly 驱动环远离下表面，如在V20和V197所见。有趣的是，这些PRE差异主要在远端PRE位点组（第2组）中看到，并表明Trp/Tyr在loop 11–12定位上的差异源于其从“家位置”的瞬时偏移。

我们还考虑了这些loop 11–12的瞬时偏移是否可以用经典的变构模型解释。我们先前表明，TrpCM主要处于T态，但动态地切换到R态，平衡群体约为8%。因此，对观察到的TrpCM和TyrCM之间PRE差异（特别是ΔI > 0）的一个 trivial 解释是，这些变化源于R构象，其中loop 11–12采用不同的取向。为了测试这种可能性，我们在无NaCl的情况下测量了TrpCM的PREs，我们已经了解到这可以淬灭向R态的偏移。如果R构象负责PRE差异，那么在0 mM NaCl下的TrpCM PREs应该类似于正常缓冲条件下的TyrCM PREs，并且通常，PRE变化预计与R群体成比例。我们的数据显示，TrpCM PREs不随盐浓度成比例变化。这在残基V197上最为明显，相对于TyrCM，它表现出大的PRE增加：其在150 mM和0 mM NaCl下的PRE比率分别为5.2 ± 0.4和5 ± 0.2。类似地，残基I129在高盐下显示PRE为2.0 ± 0.1，在无盐下为1.59 ± 0.04。此外，在pH 7.5下，我们先前报道T到R转换显著减少，残基V197和I129分别显示PRE值为5.9 ± 0.3和1.59 ± 0.06。这些数据表明，PRE检测到的运动发生在T态系综内部，并且也支持在150 mM NaCl下无法确定PREs的情况下使用0 mM NaCl PREs。

综上所述，PREs显示loop 11–12的偏移取决于CM的效应子结合状态，Trp变构地促进环紧密接近底物进入可能发生的下表面，而Tyr变构地将环 redirect 远离活性位点。虽然TrpCM和TyrCM尽管功能不同却显示出高度相似的整体构象状态，但TrpCM和TyrCM之间不同的PREs表明，loop 11–12根据结合的效应子采用不同的构象谱。loop 11–12的变构重定向影响CM活性，是远端效应子结合 purposeful 调制动态元件的一个 striking 例子。

2.4 变构环与活性位点通过原体间相互作用通信

在部分loop 11–12已解析的CM晶体结构中，环N端和C端的定位表明，loop 11–12与活性位点之间的任何潜在通信 likely 通过亚基间接触发生。虽然环在色氨酸存在下更靠近活性位点，但缺乏野生型TrpCM晶体结构 presents challenges 确定这些相互作用是源于原体间（inter-protomer）还是原体内（intra-protomer）接触。为了确定这种相互作用的性质，我们在Trp和Tyr结合的CM的MD模拟中测量了位于loop 11–12中心附近的残基S220与活性位点附近残基V197之间的距离。有趣的是，TrpCM显示出部分亚基间距离测量值在5至15 ?之间，这在TyrCM测量中未观察到，与PREs表现出极好的一致性。具体来说，在TrpCM中，loop 11–12与活性位点之间所有测量的原体间距离中有8%落在5–15 ?范围内，而在TyrCM中观察到此类距离的比例不到1%，表明当Trp结合时，loop 11–12移动得更接近伙伴亚基的活性位点。在这些模拟中，TrpCM主要保持在T构象，因为时间尺度不足以克服R构象的动能垒。因此，观察到的原体间接触源于T态内的相互作用，而不是R态，这与我们的PRE解释一致。相反，对于Trp和Tyr结合形式，所有测量的loop 11–12与V197之间的原体内距离均超过25 ?。在我们的PRE研究中，用于诱导NMR信号线宽 broadening 的氮氧自由基自旋标记的有效半径约为25 ?。所有原体内距离均大于25 ?的观察表明，环11–12与活性位点之间的亚基内相互作用 unlikely。相反，在活性位点附近区域观察到的PRE效应很可能源于一个原体的loop 11–12与相反原体活性位点附近的相互作用，表明原体之间 intricate 的 interplay 可能对CM的调控机制至关重要。

2.5 变构环改变活性位点的静电环境

Loop 11–12的调控作用似乎归因于与活性位点附近区域的亚基间变构通信，这可能对CM功能是 integral 的。令人惊讶的是，在这个柔性且非结构化的环中移除一个带电荷残基（D215）会以pH可逆的方式抑制蛋白质的活性，这表明loop 11–12重新排列蛋白质的离子环境以改变功能。这使我们假设，环的偏移功能是设置活性位点以吸引带密集负电荷的底物。为了检验这一假设，我们通过分析蛋白质在溶液中的表面静电特性，研究了loop 11–12在调制TrpCM电荷分布中的作用。

最近引入了一种创新方法，使用NMR获取蛋白质系统的近表面静电信息。该方法使用两种溶剂氮氧自由基自旋标记——一种带负电，另一种带正电——它们可以差异性地与带电位点相互作用，通过产生PRE诱导的信号 broadening 提供蛋白质表面静电性质的 insights。通过监测这些溶剂PRE（sPRE）事件，可以逐个残基地确定蛋白质的静电分布。有效近表面静电势的计算涉及使用两时间点策略确定¹H横向磁化强度的PRE速率（R₂）。正如在量化¹H甲基PRE速率时所见，这种纯R?方法在我们的研究中被证明不切实际，因为甲基弛豫速率的 wide range 以及样品数量的增加导致显著的信号 broadening 和峰消失。因此，我们采用了一种修改策略，涉及收集顺磁和抗磁样品的¹H-¹³C HMQC光谱，以最小化峰消失并 enable 快速采集不同的CM形式。作为计算静电势的代理，我们采用了一种简单的表面电荷 measure，直接来自¹H-¹³C HMQC峰强度：，其中和分别代表由负电和正电共溶质产生的sPRE效应推导出的强度比率，整合到一个统一的参数中，该参数报告CM的表面有效电荷分布。最终值为正（）表示净正电区域，而为负（）表示净负电区域。这种方法被 specifically 实施用于研究色氨酸结合的CM形式，即野生型和D215A形式，因为在这里我们观察到酶活性的显著pH依赖性变化。由于D215A突变在pH 7.5下对原本有活性的TrpCM产生抑制效应，但在pH 6.5下则没有，我们旨在研究可以解释TrpCM活性变化的静电分布变化。在比较了TrpCM^D215A和TrpCM在pH 6.5和pH 7.5下的静电学参数后，我们发现具有不同活性谱的CM形式之间存在显著差异。

TrpCM在pH 6.5和7.5下均显示 active 和双曲线活性谱，在这两个pH下显示出 largely unchanged 一致的有效净电荷分布模式，表明野生型酶在两个pH值下维持稳定的静电环境以支持其功能。应该注意的是，TrpCM的表观K_m在不同pH值下有所不同。目前尚不清楚K_m值差异 underlying 的原因，但它似乎不是来自甲基检测的sPREs所捕获的表面电荷特性。相反，在loop 11–12中引入D215A突变导致CM在pH 6.5和7.5下的有效净电荷分布出现显著差异，这反映了在提高pH时观察到的活性丧失。值得注意的是，许多显示最显著变化的残基——L12、L19、L104、V185、I201、V211、V214、I237、V238和L251——位于活性位点附近。在pH 6.5下，残基L12、L19、L104、I201、V214、I237和V238显示出比pH 7.5下显著更高的正有效净电荷。有趣的是，这些残基中的许多落在或靠近激活剂Trp存在下loop 11–12采样的区域，上文定义为第2组。这种空间相关性暗示了一种潜在的耦合机制，其中loop 11–12接近活性位点附近的区域以 facilitate 有利的静电环境，从而促进带负电底物的可及性并 enable 适当的蛋白质功能。

重要的是要考虑到，鉴于sPRE探针的带电性质，它们除了与表面相互作用外，还可能优先结合到蛋白质的高度带电口袋中，这可能会潜在 bias 观察到的有效净电荷差异。残基V111和V245的细微峰位移表明，这种结合事件，或另一个引起这些位移的扰动，可能发生在所有野生型和突变体样品中。此外，V111和V245的信号远未 bleaching，这将是 significant binding 的预期结果，可能会污染其他位点的PREs。因此，结合事件不太可能是观察到的PREs主要模式的原因。

为了进一步支持我们的sPRE静电学分析，我们为TrpCM和TrpCM^D215A在pH 6.0–8.0范围内收集了一系列酰胺主链NMR光谱。该实验允许识别整个蛋白质中表现出对pH依赖性滴定 differential 响应的特定残基。几个残基在TrpCM^D215A中表现出与野生型相比显著改变的行为。其中一个这样的残基是V197，它是TrpCM中loop 11–12接近的探针之一，如大PRE效应所证明。此外，位于显示TrpCM^D215A有效净电荷显著变化区域内或附近的残基K190、E203和E210，也显示出相对于TrpCM的滴定曲线 significant 差异。虽然观察到的细微位移差异并不 specifically 暗示哪些侧链去质子化，但这些观察提供了 additional 证据表明loop 11–12变构地调制CM的静电景观，这可能对维持最佳酶活性很重要。

在TrpCM中，D215主要保持远离活性位点。因此，其对活性的影响是变构的，并且与许多变构观察不同，在这里可以 pinpoint 产生变构效应的特定蛋白质元件。此外，似乎变构机制中存在静电成分，它可能结合了结构重定位、动力学以及直接静电扰动或间接的、广泛的CM催化结构域中静电网络重排，该网络依赖于loop 11–12位置215的电荷。结合loop 11–12的灵活性以及D215在调制酶活性中的作用，这些发现指向CM evolved 的一种复杂变构机制，这可能为理解经典变构系统中变构调控如何运作提供 insights，并为理解和探索其他蛋白质中的变构调控提供潜在框架。

3 讨论

CM的loop 11–12行为表明，超越传统结构重排的变构机制可以在调控蛋白质活性中发挥关键作用。Braus及其同事先前强调了loop 11–12在CM功能中出乎意料 yet 必不可少的作用。在本研究中，我们提供了关于loop 11–12功能作用的 further insights，并确定了一种变构机制，通过该机制它与蛋白质的关键调控区域通信以影响酶活性。使用PRE NMR，我们表明环的空间取向受到结合在距离环末端超过20 ?的效应子的影响。在激活剂Trp存在下，环表现出向活性位点的偏移，这在apoCM和TyrCM中均不存在。我们先前表明，活性位点残基V197和V20（在TrpCM中表现出高PREs）也显示出与主要T-R转换残基的偏差，表明它们的弛豫特性受到替代动态机制的影响。loop 11–12接近活性位点很可能调制这些及周围残基的动力学以 facilitate 底物 access。在TrpCM中观察到的loop 11–12的独特运动与Boehr及其同事 prior 的工作一致，他们报道了TrpCM中loop 11–12内一个残基T217的较低甲基轴序参数，表明相对于apoCM和TyrCM具有更大的灵活性。值得注意的是，跨蛋白质不同区域的PRE效应（上文第1和第2组）支持了环采样不同构象系综而不是执行二元“开放-关闭”铰链运动的观点。因此，loop 11–12在激活剂结合时并不充当锁定机制，而是探索广阔的构象景观，突出了环辅助变构调控的复杂性。

对loop 11–12行为的 further insights 来自MD模拟，模拟揭示其与活性位点的通信可能通过原体间接触发生。这些发现与PRE数据一致，表明loop 11–12间歇性地紧密接近活性位点内的 several 残基。这种远端环与活性位点之间的亚基间通信方式提供了对蛋白质协同作用机制的 insight，这是CM变构行为的标志。多项研究表明，CM表现出亚基间协同性，特别是在其apo和Tyr结合形式中。在此，我们表明在loop 11–12中引入D215A突变诱导了部分通过协同机制补偿的抑制效应，如S形活性曲线所证明。因此，loop 11–12很可能也有助于控制CM的变构协同性。这可以通过采用我们组最近开发的混合标记二聚体（MLD）策略进一步验证，该策略涉及通过点击化学将NMR可检测的CM单体与NMR沉默的伙伴连接。MLD方法可以通过跨亚基的PRE测量以及分析底物结合仅发生在同源二聚体一个亚基上的 scenario 来加以利用，从而允许研究由loop 11–12和蛋白质其他区域协调的协同性。

我们的发现揭示，该环不仅动态地访问活性位点和蛋白质的其他区域，而且这种运动可能服务于特定的功能角色。令人惊讶的是，TrpCM^D215A在pH 7.5下表现出抑制效应，但其活性在pH 6.5下恢复到野生型水平。鉴于这种pH依赖性可