基于AlphaFold2生成扩散模型UFConf的迭代结构扩散建模（IMSD）探索变质蛋白折叠转换路径

本综述创新性地提出IMSD（迭代结构扩散建模）方法，结合生成扩散模型UFConf（基于AlphaFold2网络）探索变质蛋白（MPs）折叠转换机制。该方法通过迭代“加噪-去噪”过程成功模拟了GA98、SA1 V90T和RfaH-CTD等蛋白的构象转换路径，揭示了双漏斗能量景观特征。IMSD为研究蛋白质动力学提供了高效计算工具，克服了传统分子动力学（MD）模拟的时间尺度限制，对理解蛋白质功能多样性和设计新型蛋白质具有重要意义。

　　

1 引言

蛋白质科学长期遵循"序列-结构-功能"范式，认为蛋白质序列唯一决定其三维结构，进而决定功能。然而，内在无序蛋白（IDPs）和变质蛋白（MPs）的发现突破了这一传统认知。变质蛋白能够采用两种或更多截然不同的空间结构，在功能调控中发挥重要作用。尽管实验研究表明蛋白质数据库中高达4%的蛋白质可能具有折叠转换特性，但由于替代态通常种群稀少，直接实验观测面临巨大挑战。

计算工具成为研究变质蛋白的重要手段。分子动力学（MD）模拟虽然能提供原子级分辨率，但折叠转换过程的时间尺度远超常规MD模拟能力。增强采样方法如副本交换等部分解决了这一问题，但仍存在计算成本高的问题。AlphaFold2（AF2）作为革命性的机器学习工具，在预测蛋白质结构方面取得突破，但对变质蛋白替代态的预测能力有限。

生成扩散模型（GDMs）的最新发展为蛋白质结构预测带来了新机遇。这类算法通过前向扩散（加噪）和反向扩散（去噪）过程生成蛋白质结构。UFConf是基于改进AlphaFold2网络的生成扩散算法，能够从氨基酸水平重建蛋白质结构。研究表明UFConf能成功预测多种蛋白质构象重排，包括膜转运蛋白、多域丝状蛋白和激酶等。

2 结果与讨论

2.1 UFConf单次运行能否预测两种变质折叠？

研究首先测试了UFConf在单次运行中预测六种典型变质蛋白两种折叠状态的能力。设置扩散时间参数t=1.0，使程序从完全随机的氨基酸空间分布开始生成结构，仅依靠序列信息而避免对起始结构的偏向。

以GA98为例，该蛋白是通过合理设计获得的变质蛋白，98%序列同源的GA98和GB98分别保持3α折叠和4β+α折叠。UFConf运行生成100个副本结构，计算每个副本与参考结构（GS和AS）的骨架均方根偏差（rmsd）。结果显示UFConf成功复现了GA98的GS折叠（3α），但未能恢复AS折叠（4β+α）。然而，它生成了一些更接近AS而非GS的副本，这些副本呈现出AS折叠中初生的β-片层结构特征。

其他变质蛋白的测试结果类似：SA1、XCL1、Mad2和分离的RfaH-C端结构域生成的副本都倾向于GS折叠，同时显示出一系列不同程度偏离GS模型的物种。唯一例外是全长的RfaH，UFConf同时恢复了其开放构象（C端结构域采用5β折叠，对应低种群AS状态）和封闭构象（C端结构域转变为α-螺旋发夹，类似主要GS状态）。

研究表明，UFConf通常能恢复变质蛋白的基态，但无法预测其替代态。然而，它生成了大量处于GS向AS过渡路径上的构象物种，这些可解释为折叠转换中间体。

2.2 GA98折叠转换过渡的IMSD建模

研究者开发了基于UFConf的IMSD（通过结构扩散进行迭代建模）协议来模拟变质蛋白从一种折叠到另一种折叠的路径。该方法从状态A的实验结构开始，通过加噪过程扰动该结构，然后通过反向扩散过程推断新的结构模型。从这批模型中，选择最接近替代状态B的模型作为迭代最小值（IM），以其为起点进行下一轮加噪/去噪，生成新一批副本，如此迭代进行。

在GA98从3α折叠到4β+α折叠的IMSD模拟中，采用自适应调整策略：当当前IM与AS之间的rmsd低于5?时，将t从0.5降至0.4；当rmsd进一步低于3?时，将t降至0.3；当rmsd达到2?时终止模拟。

模拟结果显示，从GS模型开始的仿真最终到达了与AS模型相差2?以内的状态，成功实现了折叠转换。轨迹呈现特征性的回旋镖形状，与双漏斗能量景观中折叠转换过渡的增强MD模拟结果一致。轨迹分析揭示了关键转换事件：早期α3螺旋的溶解，随后β3-β4发夹的形成和α2螺旋的扩展，接着N端β1-β2发夹结构的成核，最终形成与AS状态相似的完整β-片层。

重复轨迹和反向过渡（从AS到GS）的模拟都证实了关键转换事件的顺序和可重复性。这些结果与实验数据高度一致：二级结构预测器（AGADIR、Jpred4、PSSPred）均表明α3区域螺旋性低但具有相当β-片层倾向性；突变Φ分析表明GA88的全螺旋折叠由α1和α2螺旋中的残基簇支撑；GB1蛋白的实验研究也证实β3-β4发夹是折叠核的一部分，而边缘链β2是β-片层的最后添加部分。

2.3 SA1 V90T折叠转换过渡的IMSD建模

SA1是基于嗜热菌S6核糖体蛋白的人工设计变质蛋白，其11-66位残基被GA结构域的56个残基序列替换。该嵌合构建体具有采用两种不同折叠的潜力：S6核糖体蛋白天然的α/β折叠或GA序列编码的全α折叠。SA1 V90T单点突变揭示了替代态的存在，使得能够在HSQC谱中观察到GS和AS物种的混合物。

IMSD模拟需要针对SA1 V90T进行特殊调整。初始尝试使用t=0.5未能成功，后改用t=1.0有效驱动蛋白质脱离"GS阱"。此外，由于AS模型具有长的无序尾巴，在精炼阶段将rmsd计算限制在AS的结构部分（残基15-80），显著改善了AS附近的收敛性。

模拟结果显示，初始使用t=1.0时，UFConf仅基于序列信息构建结构模型，所有这些模型都与GS相似，但已开始出现差异：β4链在IM1中就已丢失。随后20次迭代中观察到剩余β-片层的逐渐恶化，β结构完全丢失后又在IM24-IM27中短暂重建，随后β3位置开始形成新的α螺旋（按AS命名法为α3），最终形成全螺旋排列。

最终在IM41中形成了具有正确拓扑结构的三螺旋束α1-α2-α3，与AS模型一致。经过15轮额外精炼后，系统到达IM56，与AS折叠非常相似，其中α4相对于AS模型保持倾斜，可能比AS模型更好地代表了替代态。

2.4 分离的RfaH-CTD折叠转换过渡的IMSD建模

细菌转录抗终止蛋白RfaH由两个结构域组成，在自由状态下采用自动抑制的封闭构象，CTD以αα-发夹形式与NTD包装。当RfaH与ops暂停的RNA聚合酶结合后，CTD从NTD解离并迅速重折叠为β-桶，转化后的CTD与核糖体结合，启动新合成RNA的现场翻译。

分离两个结构域通过蛋白酶切导致CTD转换为β-桶形式，当作为单独构建体表达时，RfaH-CTD采用β-桶构象。两种折叠（β-桶和αα-发夹）都编码在RfaH-CTD序列中，域间相互作用简单地使后者优于前者。

IMSD模拟使用相同的默认协议，从GS模型开始逐渐远离基态：到IM11时丢失了边缘链β4，相邻链β3变短；几次迭代后，原始β-桶排列中仅存短的β2-β3片段，拓扑结构变为扭曲发夹；从IM14到IM15拓扑结构进一步改变，后者没有可识别的二级结构，但可见α2螺旋的成核（残基137-145）和α1的成核（残基121-127）。

从几乎无结构的IM15开始，系统开始重折叠为替代构象，轨迹转向下移动，减少与AS模型的rmsd。IM16中观察到部分形成的αα-发夹，背面带有β1-β5配对，这种称为βααβ单元的安排可在变质蛋白KaiB中找到。随后的迭代中这种特殊安排消失，让位于扩展的αα-发夹，经过12轮精炼后，两个螺旋对齐，发夹进一步扩展，最终状态IM29与目标AS模型非常相似。

实验数据支持这些发现：氢键耦合测量表明β2-β3配对是β-片层最稳定的部分；CEST测量和尿素滴定数据表明RfaHCTD样品含有约5%的未折叠次要物种，但具有两个具有螺旋倾向的区域：127-131和136-150，这些区域具有升高的¹⁵N R₂弛豫速率，可能来自螺旋-线圈交换。这些观察与IM15中137-145区域被识别为α2成核位点的结果一致。

3 结论与展望

IMSD方法在概念上类似于Harada和Kitao提出的平行级联选择分子动力学（PaCS-MD）方案，关键区别在于通过生成扩散算法（加噪-去噪步骤）而不是常规MD运行来进化结构。加噪量（即对系统的结构扰动幅度）可以任意大，这意味着IMSD可以克服高能垒，使其适用于模拟主要结构重排如变质转变。

与用于模拟折叠转换过渡的分子动力学方法相比，IMSD方案具有明显优势。当前力场甚至在模拟球状蛋白质方面都存在问题，再现变质蛋白的折叠转换中间体显然更加困难。IMSD的关键前提是最新一代预测器（如基于AF2的生成扩散算法UFConf）不仅能够有意义地预测完全折叠的蛋白质形式，还能预测部分折叠的中间体。

IMSD方法有多种参数化方式，除rmsd外还可使用其他集体变量如GDT-HA、TM分数或天然接触分数Q。基于Q的IMSD方案在某些情况下能成功再现变质转变，但并非所有情况都适用。

UFConf配备的两种原始算法中，朗之万动力学适合模拟腺苷酸激酶中的域动力学，但不适合跨越任何显著能垒；结构插值算法虽然能追踪SA1 V90T中的折叠转换过渡，但未能通过阴性对照测试，将SA1 V90T错误重折叠为不相关的HIV-1蛋白酶折叠。

研究表明，基于GDM的算法有多种可能来模拟变质蛋白中的折叠转换过渡。目前，rmsd驱动的IMSD方案似乎能产生最佳结果，为理解蛋白质功能多样性和设计新型蛋白质提供了强大工具。未来，类似算法可能发展到模拟变质进化路径（即通过累积序列变化从一种折叠进化到另一种），IMSD方案可能在探索这种转变中发挥作用。