松材线虫精准检测新技术：微滴数字PCR与RPA-LFA方法的建立与应用

本研究针对松材线虫病早期检测难题，开发了基于5S rRNA基因的微滴数字PCR(ddPCR)和重组酶聚合酶扩增-侧向流动层析(RPA-LFA)两种检测技术。ddPCR可实现松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的绝对定量检测，灵敏度达0.32拷贝/μL；RPA-LFA可在20分钟内完成现场快速检测，与qPCR结果一致性达100%。该研究为松材线虫病的精准监测和现场筛查提供了双轨化解决方案。

　　

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)作为松材线虫病(pine wilt disease, PWD)的病原体，是全球最具破坏性的植物寄生线虫之一。该病害在欧亚地区尤其是日本和中国造成严重的松林资源损失和生态系统破坏。由于松材线虫传播迅速且致病性强，树木感染后死亡率极高，而目前缺乏有效的防治措施，使得早期准确检测成为控制病害扩散的关键。传统诊断方法主要依赖形态学鉴定，但这种方法耗时且需要专业分类知识，因此分子检测技术已成为当前的主要鉴定手段。虽然常规PCR、实时定量PCR(qPCR)等技术已应用于松材线虫检测，但qPCR只能进行相对定量，需要依赖参考基因，且无法实现绝对定量。此外，现有技术在现场快速检测方面的应用仍存在局限。

为应对这些挑战，研究人员开发了微滴数字PCR(ddPCR)和重组酶聚合酶扩增-侧向流动层析(RPA-LFA)两种新型检测方法。ddPCR技术能够实现核酸分子的绝对定量，具有高灵敏度和抗干扰能力强的特点，特别适合低浓度和复杂背景样品的检测。RPA作为一种等温扩增技术，可在恒温条件下快速完成核酸扩增，结合侧向流动层析检测，非常适合现场和资源有限条件下的快速检测。

本研究采用的主要技术方法包括：基于CTAB法的线虫基因组DNA提取、针对5S rRNA基因设计的特异性引物和探针、微滴数字PCR(ddPCR)绝对定量分析、实时定量PCR(qPCR)比较验证、重组酶聚合酶扩增(RPA)反应体系优化以及侧向流动层析(LFA)检测。研究样本包括实验室培养的松材线虫和现场采集的22份辽宁抚松疫区松木样品。

Development of the ddPCR assay

研究人员建立了针对松材线虫5S rRNA基因的ddPCR检测体系。通过优化退火温度(55°C)、引物浓度(900 nM)和探针浓度(150 nM)，获得了最佳反应条件。特异性实验表明，该体系只能检测到松材线虫DNA的阳性信号，而对近似种B. mucronatus和无模板对照(NTC)均无交叉反应，证明该方法具有良好的特异性。

Development of the RPA-LFA assay

针对现场检测需求，研究人员开发了RPA-LFA方法。通过筛选特异性探针(探针2)，建立了可在37°C恒温条件下反应20分钟的快速检测体系。该方法不需要复杂仪器设备，适合现场应用。验证实验表明，该方法能够准确检测至少75条松材线虫。

Comparison of the molecular sensitivity of the ddPCR and RPA-LFA

灵敏度比较实验显示，ddPCR检测限达到0.32拷贝/μL(每反应6.4拷贝)，而RPA-LFA在25分钟内的检测限为2.8×10¹拷贝/μL。虽然RPA-LFA的灵敏度低于ddPCR，但在检测时间和现场适用性方面具有明显优势。

Comparison between ddPCR and qPCR assays for quantifying B.xylophilus

方法比较研究表明，ddPCR的灵敏度比qPCR高约5倍。线性回归分析显示两种方法都具有良好的线性关系(R²=0.99)，且定量结果显著相关(R²=0.96)。ddPCR的批内和批间变异系数(CV)分别为3.47%-6.71%和2.63%-7.30%，表明该方法具有良好的重复性和重现性。

Application of the ddPCR, qPCR, and RPA-LFA to pinewood samples

应用22份现场松木样品的检测结果显示，ddPCR检出19份阳性(86.36%)，qPCR检出16份阳性(72.73%)，RPA-LFA也检出16份阳性。有5份qPCR和RPA-LFA检测为阴性的样品被ddPCR检出阳性，表明ddPCR对低浓度样品的检测更加可靠。所有RPA-LFA阳性样品都能被ddPCR检测到，且总反应时间少于1小时，显著缩短了检测时间。

本研究建立的ddPCR检测方法能够实现松材线虫的绝对定量，检测灵敏度达到0.32拷贝/μL，比传统qPCR方法灵敏度提高5倍，且不需要标准曲线或参考基因，定量结果更加可靠准确。RPA-LFA方法可在20分钟内完成检测，与qPCR结果一致性达100%，非常适合现场快速筛查。两种方法的结合使用为松材线虫病的监测防控提供了完整的解决方案：ddPCR适用于实验室精确定量分析，而RPA-LFA则适用于现场快速检测。这种双轨化检测策略能够满足不同条件下松材线虫病检测的多样化需求，为有效控制该病害的传播提供了重要的技术支撑。该研究成果发表在《Phytopathology Research》期刊上，为森林病害的诊断检测提供了新的技术范例。