抑制DDR1通过促进铁死亡和免疫原性死亡增强头颈部鳞状细胞癌碳离子放疗效果

本研究针对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）碳离子放疗（CIR）抵抗难题，揭示了DDR1通过形成DDR1/14-3-3/Akt三元复合物激活Akt/mTORC1/SREBP1/SCD1轴抑制铁死亡的新机制。研究表明，靶向DDR1可破坏该复合物，促进脂质过氧化和免疫原性细胞死亡（ICD），增强CD8+T细胞浸润，显著提升CIR疗效。该发现为HNSCC联合治疗提供了新策略。

　　

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，具有显著的肿瘤异质性。尽管放疗是其治疗基石，但约70%的患者确诊时已处于局部晚期，其中15-50%的患者在接受放化疗后出现局部复发。对于既往接受过放疗的复发患者，再照射效果欠佳，5年生存率仅为10-30%。碳离子放疗（CIR）因其独特的"布拉格峰"能量沉积特性和高线性能量转移（LET）特性，能够克服传统光子放疗的抵抗问题，尤其对缺氧或静止期肿瘤细胞具有更强杀伤力。临床数据显示，初治HNSCC患者接受CIR的3年局部控制率达83.5%，复发患者再照射的1年生存率和局部控制率分别为95.9%和84.9%。然而，单独使用碳离子再照射的2年局部控制率仍不理想（40-60%），表明需要开发联合治疗策略来进一步提高疗效。

近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现为肿瘤治疗带来了革命性变化。临床前和早期临床研究表明，光子放疗与ICIs通过增强肿瘤抗原释放和免疫激活产生协同效应。然而，一项多中心随机前瞻性临床研究显示，光子放疗联合PD-1抑制剂帕博利珠单抗并未显著改善局部晚期HNSCC的肿瘤控制和生存，提示需要优化放疗-免疫联合策略。有趣的是，新兴证据表明高LET碳离子在免疫调节能力上可能超越光子，通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）、促进肿瘤相关抗原释放、多样化T细胞受体库和重编程免疫抑制性肿瘤微环境（TME），CIR能够增强全身抗肿瘤免疫并放大免疫治疗效果。

同时，寻找新的分子靶点以优化治疗反应至关重要。盘状结构域受体1（DDR1）是一种具有酪氨酸激酶活性的胶原受体，作为肿瘤-基质相互作用和免疫逃避的调节因子而备受关注。研究表明，DDR1通过切割的胶原I结合触发NF-κB-NRF2信号传导，增强巨胞饮作用和线粒体生物发生，促进胰腺癌模型的肿瘤进展。值得注意的是，DDR1胞外域介导胶原纤维重塑以限制乳腺癌中的免疫浸润，而DDR1抑制则促进细胞毒性淋巴细胞招募和肿瘤抑制。此外，DDR1水平异常升高与多种恶性肿瘤中的促炎因子呈负相关，表明DDR1可能成为潜在的免疫治疗靶点。然而，靶向DDR1与CIR联合治疗的肿瘤抑制效应和免疫反应尚未阐明，特别是在HNSCC中。

基于这些知识空白，本研究旨在探讨DDR1抑制与CIR联合对HNSCC肿瘤细胞清除和免疫调节的组合效应，并探索其抗肿瘤功效的潜在机制，涉及AKT/mTOR信号通路和免疫原性铁死亡途径。这项工作将为HNSCC治疗建立具有转化潜力的新型治疗范式的临床前证据。

研究人员主要采用以下关键技术方法：使用TCGA-HNSC数据集进行生物信息学分析；通过慢病毒感染构建DDR1敲低细胞系；采用CCK-8和集落形成实验评估细胞活力和增殖；通过流式细胞术和免疫荧光测量免疫原性和肿瘤浸润淋巴细胞；利用RNA测序和生物信息学分析肿瘤抑制机制；使用MDA、BODIPY 581/591 C11、FerroOrange和DCFH-DA探针检测铁死亡标志物（脂质过氧化、铁、ROS）；通过蛋白质印迹、免疫共沉淀、关键分子调节剂给药和SCD1过表达分析上游铁死亡机制；建立MOC1细胞系荷瘤C57BL/6小鼠模型进行体内研究。

DDR1过表达与免疫逃避和HNSCC不良预后相关

TCGA-HNSC数据集分析显示，与正常组织相比，肿瘤组织中DDR1显著上调。ROC曲线分析进一步证明了DDR1在HNSCC中的诊断效用，曲线下面积（AUC）为0.757。重要的是，Kaplan-Meier生存分析显示，高DDR1表达患者的总生存期显著缩短。免疫相关分析发现，DDR1表达与CD8B、GZMB、IFNG和IL12B表达以及T细胞、CD8 T细胞和细胞毒性细胞评分呈负相关。这些发现表明DDR1通过介导免疫逃避推动肿瘤进展和治疗抵抗。

DDR1抑制增强HNSCC对CIR的敏感性

研究人员通过慢病毒感染构建了稳定的DDR1敲低MOC1和Cal27细胞。集落形成和CCK-8实验显示，shDDR1联合CIR（shDDR1+CIR）显著降低了细胞存活率。此外，DDR1敲低与CIR联合深刻抑制了MOC1细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）。在同系MOC1皮下肿瘤模型中，shDDR1+CIR显著抑制了肿瘤生长，免疫组化（IHC）显示shDDR1+CIR肿瘤中Ki67表达降低，表明增殖活性减弱。

联合DDR1抑制和CIR促进免疫原性细胞死亡

研究发现shDDR1+CIR联合治疗显著增加了肿瘤细胞表面损伤相关分子模式（DAMPs）的暴露，如钙网蛋白（CRT）和热休克蛋白90（HSP90）。同时，MOC1细胞上的MHC-I和Cal27细胞上的HLA-A、B、C也呈现类似趋势，表明DDR1抑制和CIR联合显著增强了HNSCC细胞的免疫原性。体内实验显示，联合治疗组CD8+T淋巴细胞浸润显著增强，肿瘤组织中颗粒酶B表达显著升高，CD8+T细胞中IFN-γ产生能力增强。值得注意的是，联合治疗诱导了CD8+T细胞表面PD-1分子上调，提示与抗PD-1免疫检查点抑制剂联合可能获得更好的抗肿瘤效果。

铁死亡执行是DDR1抑制联合CIR抗肿瘤作用的基础

RNA测序分析发现，铁死亡通路在差异表达基因中显著富集。进一步研究表明，shDDR1+CIR处理诱导了丙二醛（MDA）和脂质过氧化的最大升高，非靶向脂质组学分析显示实验组中多不饱和脂肪酸磷脂（PUFA-PLs）显著富集。细胞内Fe²⁺和活性氧（ROS）水平检测显示shDDR1+CIR处理细胞中Fe²⁺和ROS积累最为明显。透射电镜（TEM）分析显示shDDR1+CIR组线粒体形态变化最为明显。蛋白质印迹分析显示联合组中GPX4和SLC7A11显著下调，Hmox1上调。这些发现表明联合DDR1抑制和CIR诱导了HNSCC中铁死亡驱动的肿瘤细胞死亡。

使用Fer-1抑制铁死亡可有效消除shDDR1+CIR组中MDA水平、脂质过氧化和Fe²⁺水平的升高。此外，Fer-1部分缓解了DDR1抑制和CIR引起的CRT、HSP90和MHC-I水平的显著增强。体内实验使用Lipro-1作为铁死亡拮抗剂，免疫组化分析显示shDDR1+CIR组中4-羟基壬烯醛（4-HNE）显著升高，而Lipro-1共同治疗可显著缓解这一现象。Lipro-1给药显著减少了所有治疗组中肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞群体，联合DDR1抑制和CIR的抗肿瘤功效在铁死亡阻断后显著受损。这些发现证实铁死亡激活是联合DDR1抑制和CIR在HNSCC中引发免疫原性细胞死亡的关键机制。

DDR1通过14-3-3相互作用调节Akt/mTOR信号影响碳离子放射敏感性

KEGG通路富集分析发现PI3K-Akt信号通路显著富集。蛋白质印迹实验显示，DDR1敲低和CIR处理后PI3K（Tyr458）、Akt（Ser473）和mTOR（Ser2448）磷酸化显著减弱。使用Akt抑制剂MK-2206可加剧脂质过氧化和MDA积累，而Akt激动剂SC79有效减弱了DDR1抑制和CIR引起的脂质过氧化和MDA水平升高。mTORC1激动剂MHY1485也表现出类似的挽救效应。免疫共沉淀实验证实DDR1与14-3-3蛋白存在相互作用，并且DDR1与Akt的结合依赖于14-3-3。这些发现建立了DDR1通过14-3-3参与Akt/mTOR信号的机制轴，从而调节对碳离子照射的细胞反应。

联合DDR1抑制和CIR通过抑制mTOR/SREBP1/SCD1介导的脂肪生成诱导铁死亡

qPCR和蛋白质印迹实验显示，联合治疗后SREBP1及其下游效应因子SCD1显著下调。mTOR激动剂MHY1485挽救了DDR1敲低和CIR诱导的SREBP1和SCD1表达降低。SCD1是一种必需的脂质去饱和酶，能够将饱和脂肪酸（SFAs）转化为单不饱和脂肪酸（MUFAs）。研究人员补充外源性MUFA油酸（18:1，OA）和SFA硬脂酸（18:0，SA），发现与SA不同，OA的添加能够降低DDR1敲低和CIR引起的脂质过氧化水平升高。为进一步确认SCD1在铁死亡中的作用，研究人员在MOC1细胞中过表达SCD1，观察到细胞脂质过氧化水平显著降低。CCK-8增殖和集落形成实验表明SCD1过表达可增强细胞活力。这些结果表明抑制DDR1联合CIR通过抑制mTOR/SREBP1/SCD1介导的脂肪生成促进HNSCC细胞铁死亡。

DDR1抑制剂7rh增强CIR敏感性抑制HNSCC肿瘤生长

为增强DDR1作为HNSCC治疗靶点的临床转化价值，研究人员使用高选择性DDR1抑制剂7rh与碳离子治疗联合，观察其对HNSCC的放射增敏作用。结果显示7rh显著抑制HNSCC细胞增殖并增强对碳离子照射的放射敏感性。机制上，7rh处理诱导脂质过氧化升高、Fe²⁺积累和ROS水平升高，以及PI3K（Tyr458）、Akt（Ser473）和mTOR（Ser2448）磷酸化和14-3-3水平的降低，从药理学上证实DDR1抑制通过抑制Akt/mTOR通路促进铁死亡，从而使细胞对放疗敏感。体内实验显示7rh和CIR联合表现出显著的肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞增加以及显著的肿瘤生长抑制和回归趋势。这些结果表明7rh可有效促进肿瘤细胞铁死亡并增强CIR在HNSCC中诱导的抗肿瘤免疫反应。

本研究确立了DDR1作为HNSCC的有前景治疗靶点，特别是用于增强CIR疗效。研究发现DDR1通过形成14-3-3介导的DDR1/14-3-3/Akt三元复合物促进Akt/mTOR信号通路激活，从而在HNSCC细胞中维持肿瘤细胞存活。遗传沉默和药理学抑制DDR1破坏了这一复合物，有效抑制了mTORC1依赖的SREBP1/SCD1调节。这种代谢重编程减弱了MUFA生物合成，从而 alleviated MUFA介导的铁死亡抑制。 resultant 铁死亡增强增加了肿瘤免疫原性，促进CD8+T细胞浸润并增强CIR介导的抗肿瘤效果。

这些发现强调了靶向DDR1作为通过免疫原性铁死亡诱导增强HNSCC中CIR的新治疗策略的重要性。研究证实了DDR1在HNSCC中的过表达与不良预后相关，且与免疫逃避机制密切相关。从机制上讲，研究揭示了DDR1通过调节PI3K/Akt/mTOR-SREBP1/SCD1信号轴影响铁死亡敏感性的新功能，为理解DDR1在肿瘤生物学中的作用提供了新视角。

研究的临床意义在于：首先，DDR1抑制剂7rh与CIR联合显示出显著的抗肿瘤效果，为临床转化提供了直接证据；其次，研究发现联合治疗可增加PD-1在CD8+T细胞的表达，提示与免疫检查点抑制剂联合可能产生协同效应；第三，铁死亡作为新兴的细胞死亡方式，其与免疫原性死亡的关联为肿瘤免疫治疗提供了新思路。

然而，该研究也存在一些局限性：首先，DDR1抑制联合CIR的临床验证尚未进行，此类试验对桥接临床前和转化研究至关重要；其次，单细胞分析可进一步阐明DDR1阻断和CIR对微环境的重塑；第三，鉴于DDR1敲低减弱了肿瘤侵袭和迁移，对生存/增殖机制的关注需要扩大对DDR1在转移调控中作用的研究。

总之，这项工作将DDR1靶向定位为通过免疫原性铁死亡诱导增强HNSCC中CIR的新治疗策略。研究结果支持将DDR1抑制剂作为放射增敏佐剂进行临床探索，特别是对于常规治疗失败的难治性或复发性HNSCC。该研究不仅为HNSCC治疗提供了新的联合策略，也为理解铁死亡与肿瘤免疫的交叉对话提供了重要见解，具有重要的理论意义和临床转化价值。