一种利用DNA/蛋白质分子订书钉进行单克隆抗体内化高通量筛选的方法

《Small Methods》：A Method for High-Throughput Screening of Monoclonal Antibody Internalization Using a DNA/Protein Molecular Staple

单克隆抗体（mAbs）与细胞受体结合及内部化效率的评估对疗法开发至关重要。本研究提出了一种简化的“one-pot”DNA/蛋白staples技术，无需化学修饰或纯化即可高效结合mAbs和荧光传感器，通过流式细胞术快速检测结合与内部化。实验验证了该方法与之前点击化学法等效，并成功应用于13种靶向T/B细胞受体的mAbs，发现高结合不一定伴随高内部化，提示需综合评估受体特性与mAbs功能。

　　本文主要探讨了如何利用一种新型的“单管蛋白支架传感器”系统，以更简便和高效的方式评估单克隆抗体（mAbs）与细胞表面受体的结合及内化行为。这一研究对于优化抗体药物的设计、提升靶向治疗的精准性和有效性具有重要意义。传统的评估方法通常涉及复杂的化学修饰和繁琐的纯化步骤，这在实际应用中限制了其高通量筛选的能力。因此，研究团队开发了一种无需化学修饰即可完成抗体与传感器结合的“单管”方法，该方法具有较高的操作简便性和可重复性，能够用于多种免疫细胞受体的快速分析。

单克隆抗体作为一种重要的治疗手段，已被广泛应用于免疫治疗领域，如靶向T细胞和B细胞的抗体药物，用于治疗多种癌症、自身免疫性疾病等。抗体不仅可以直接阻断细胞表面受体的功能，还能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）机制促进靶细胞的破坏。然而，抗体的治疗效果不仅取决于其与受体的结合能力，还与受体的内化效率密切相关。内化效率是受体将抗体摄入细胞内部的能力，这种能力可能受到多种因素的影响，包括抗体的结合位点、亲和力以及受体本身的生物学特性。

为了准确评估抗体的内化效率，研究团队设计了一种基于DNA的“内化传感器”，并结合了一种蛋白支架，以实现抗体与传感器的高效结合。这种传感器能够通过荧光信号的变化，区分细胞表面结合的抗体与内化的抗体。传统的内化评估方法往往需要复杂的步骤，如荧光淬灭、表面洗涤或二次抗体标记等，而这些方法在操作过程中可能引入误差或影响细胞活性。相比之下，单管蛋白支架传感器通过一种自组装的方式，将抗体、传感器和淬灭探针在单一反应体系中结合，避免了复杂的化学修饰和纯化过程，从而提高了实验的效率和准确性。

在实验中，研究人员选择了多种与T细胞和B细胞相关的重要受体，如CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD19、CD20、CD22、CD27、CD38、CD44和CD45等，以评估不同抗体与受体的结合和内化效率。通过将这些抗体与传感器结合，并在细胞表面进行荧光信号的淬灭处理，可以精确测量抗体的内化效率。结果显示，尽管某些抗体表现出较强的结合能力，但其内化效率却并不一定高。例如，CD2受体虽然在T细胞表面高度表达，但其内化效率较低，而CD3和CD22则表现出较高的内化效率。此外，研究还发现，CD4和CD8a虽然在T细胞表面具有较高的表达水平，但它们的内化效率却相对较低，这说明不同的受体可能具有不同的内化机制。

对于B细胞相关受体，如CD19、CD20和CD22，研究团队也进行了类似的分析。其中，CD22的内化效率较高，这使其成为一种理想的靶点，用于抗体药物的内化途径研究。而CD19虽然表达水平较高，但其内化效率较低，这可能与其受体的特性或抗体结合位点有关。CD20的内化效率也相对较低，尽管其结合能力较强，这表明抗体的内化效率与结合能力之间并没有直接的正相关关系。

通过这些实验，研究团队揭示了一个关键的发现：抗体的内化效率不仅取决于其与受体的结合能力，还受到受体本身的内化特性影响。这意味着，在开发抗体药物时，不能仅依赖于结合能力的评估，还需要综合考虑其内化效率。例如，某些抗体可能更适合用于抗体药物偶联物（ADC），因为它们能够快速内化并释放药物；而另一些抗体则更适合用于表面结合的免疫调节药物，因为它们的内化效率较低，能够持续阻断受体功能。

该研究提出的单管蛋白支架传感器系统，不仅能够实现高通量的筛选，还能为抗体药物的开发提供关键的生物信息。通过这种系统，研究人员可以更准确地评估抗体在不同细胞类型中的结合和内化行为，从而优化抗体设计，提高治疗效果。此外，该方法还可以扩展到其他类型的DNA-蛋白质偶联物，如抗病毒的核酸药物或基因治疗相关的载体，为未来的生物医学研究提供新的工具。

总之，这项研究为抗体药物的开发提供了一种新的评估手段，能够更高效地分析抗体与受体的结合和内化行为。这种方法的简便性和可重复性，使其在未来的临床研究和药物开发中具有广泛的应用前景。通过这种系统，科学家可以更好地理解抗体药物的作用机制，从而为精准医学的发展做出贡献。