双分子靶向策略增强慢病毒载体对VEGFR2表达细胞的基因递送效率

本研究针对肿瘤血管靶向基因治疗中慢病毒载体（LVs）转导效率低的问题，开发了一种双分子靶向策略（TMTA），通过独立共展示结合模块（VEGFR2特异性纳米抗体3VGR19或天然配体VEGF121）和融合模块（去靶化的Sindbis病毒糖蛋白突变体），在VEGFR2高表达细胞中实现高达91%的转导效率，显著优于传统嵌合策略的30%，为靶向基因治疗提供了更高效的模块化平台。

　　

在癌症基因治疗领域，系统性递送治疗基因至转移病灶仍面临特异性、效率和安全性的三重挑战。肿瘤相关内皮细胞（TAECs）作为肿瘤血管生成的关键介质，因其高表达血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）且直接接触血液循环系统，成为理想的靶向治疗靶点。然而，传统嵌合型慢病毒载体（LVs）虽能实现靶向递送，却因靶向模块与融合糖蛋白的结构冲突导致转导效率受限（仅约30%），严重制约了其临床应用潜力。

为突破这一瓶颈，Ahani团队在《Virology Journal》发表的研究中，创新性地采用双分子靶向策略（Two-Molecules Targeting Approach, TMTA），将靶向模块（VEGFR2特异性纳米抗体或VEGF₁₂₁配体）与去靶化但保留融合活性的Sindbis病毒糖蛋白（SVG突变体2.2-L）独立共展示于病毒颗粒表面，成功将转导效率提升至72%-91%，为靶向基因治疗提供了高效灵活的解决方案。

本研究核心采用四种关键技术：1）分子构建技术：基于pDisplay和pDF骨架设计含不同跨膜域（PDGFR/CD28）和间隔域（HL/Fc）的膜锚定靶向分子；2）病毒包装技术：通过三质粒系统共转染293T细胞生产伪型化慢病毒；3）功能验证技术：通过流式细胞术、Western blot、病毒捕获ELISA和病毒-细胞结合实验验证靶向分子与融合蛋白的共整合与功能；4）计算模拟技术：通过分子动力学模拟分析靶向模块与脂质双层的距离效应。

结果分析

靶向分子的细胞表面表达与病毒整合

通过Western blot和流式细胞术证实，所有设计的膜锚定纳米抗体（mNbs）和VEGF₁₂₁（mVEs）均在病毒生产细胞表面高效表达，且与SVG突变体共整合至病毒颗粒。其中，插入螺旋 linker（HL）的Dis-Nb-HL表达量较基础版本提升1.5倍，而含Fc间隔域的DF-Nb展示效果最佳。

病毒结合特异性与共展示验证

病毒捕获ELISA显示，所有靶向LVs均能特异性结合VEGFR2（较BSA对照组结合率提升显著，P<0.0001），而阴性对照病毒（2.2-L）仅呈背景结合。病毒-细胞结合实验进一步证实，靶向病毒能与VEGFR2表达细胞（293/KDR）结合，且抗His标签抗体检测证实SVG与靶向分子共存于同一病毒颗粒。

转导效率与靶向性提升

在293/KDR细胞中，DF-Nb/2.2-L病毒的转导效率达72%，显著高于嵌合策略的30%；Dis-Nb-HL/2.2-L（37%）和Dis-Nb/2.2-L（14%）依次递减。值得注意的是，含Fc间隔域的构建体（DF-Nb）转导效率最高，而移除Fc域（DF-Nb-ΔFc）则骤降至5%，表明间隔域长度对靶向活性至关重要。VEGF₁₂₁展示病毒（DF-VE/2.2-L）效率达91%，且不受间隔域修饰影响，印证了配体-受体结合的空间独立性。

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计算模拟揭示距离效应机制

分子动力学模拟显示，靶向模块与脂质双层的距离与转导效率呈正相关：DF-Nb（82.01 ?）> Dis-Nb-HL（68.40 ?）> Dis-Nb（28.26 ?）> DF-Nb-ΔFc（0 ?），对应转导效率分别为72%、37%、14%和5%。该结果首次揭示靶向模块的膜远端布局可显著增强其与受体结合的空间可及性。

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结论与意义

本研究通过双分子靶向策略成功解决了嵌合型LVs转导效率低的核心问题。该策略的模块化特性允许独立优化靶向配体、跨膜域和间隔域，为快速开发针对不同靶点的定制化载体提供了平台。值得注意的是，纳米抗体的效率高度依赖间隔域长度，而天然配体VEGF₁₂₁因结合膜远端结构域则不受此限制。虽含Fc域的构建体效率最高，但需警惕其与Fcγ受体非特异性结合的风险，未来需通过突变Fc结合位点消除脱靶效应。此外，该策略虽提升靶向效率，但非特异性转导（3%-6%）仍略高于嵌合载体（1%），提示需进一步优化去靶化融合蛋白的设计。

总体而言，该研究为肿瘤血管靶向治疗提供了高效、灵活的基因递送系统，其“即插即用”的特性有望加速靶向基因治疗的临床转化。