宿主lncRNA-PAAN的二级结构解析及其作为抗甲型流感药物靶点的潜力研究

本研究针对甲型流感病毒(IAV)易变异导致药物快速失效的难题，聚焦宿主非编码RNA lncRNA-PAAN的结构与功能。研究人员通过化学探针测绘和计算建模，首次解析了lncRNA-PAAN在体外和细胞环境中的二级结构，鉴定出多个稳定功能模体，并设计出可显著抑制病毒复制的反义寡核苷酸(ASOs)，为靶向宿主因子的抗流感策略提供了新方向。

　　

甲型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）因其高变异性和快速演化能力，被视为全球最危险的病原体之一。现有抗流感药物面临耐药性迅速出现的严峻挑战，疫苗效果也因季节不同而波动。因此，开发具有新作用机制且耐药性风险低的抗病毒策略成为当务之急。近年来，宿主长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）因其在病毒-宿主相互作用中的关键作用受到关注。与流感病毒的RNA或蛋白相比，宿主lncRNA的变异性较低，因此可能成为更稳定和通用的抗病毒靶点。其中，lncRNA-PAAN（PA-associated noncoding RNA）是IAV感染过程中上调的一种宿主lncRNA，它与病毒PA蛋白相互作用，促进病毒RNA聚合酶复合物的形成，从而影响病毒RNA（vRNA）的合成。然而，关于lncRNA-PAAN的结构信息，尤其是在生物环境中的构象，此前尚未被揭示。

为了填补这一空白，本研究由波兰科学院生物有机化学研究所的Izabela Ulanowska、Ryszard Kierzek、Elzbieta Kierzek和Marta Soszynska-Jozwiak合作完成，并发表在《Journal of Biological Chemistry》。研究人员综合运用化学探针测绘（包括DMS、CMCT和NMIA修饰）、SHAPE（Selective 2′-Hydroxyl Acylation Analyzed by Primer Extension）方法、计算预测（ScanFold 2.0和RNAstructure 6.4）以及细胞实验，首次提出了lncRNA-PAAN在体外和细胞环境中的二级结构模型，并基于这些结构设计了靶向特定模体的反义寡核苷酸（ASOs），成功抑制了IAV的复制。

研究主要采用了以下几种关键技术方法：

1. 1.
   化学探针测绘：在体外和感染IAV的A549细胞裂解液环境中，使用DMS、CMCT和NMIA对lncRNA-PAAN进行修饰，通过荧光标记引物和毛细管电泳检测单链可及区域。
2. 2.
   RNA结构预测与建模：利用ScanFold 2.0进行z-score分析识别潜在功能模体；通过RNAstructure 6.4整合实验数据预测最小自由能（MFE）和最大期望精度（MEA）结构；采用Rsample和IPANEMAP分析结构动态性与多样性。
3. 3.
   反义寡核苷酸设计与验证：针对鉴定出的单链区域设计2′-O-甲基化和LNA修饰的ASOs，转染至IAV感染的A549细胞，通过RT-qPCR评估其对lncRNA-PAAN水平和病毒复制的影响。
4. 4.
   细胞与病毒学实验：使用A/California/04/2009 (H1N1)病毒株感染人肺上皮A549细胞，通过Western blot检测病毒蛋白表达，并通过细胞活力试验确保ASOs无毒性。

计算结果与讨论

Computational Predictions of Potential Functional RNA Structures of lncRNA-PAAN

通过ScanFold 2.0分析，研究人员发现lncRNA-PAAN的序列中存在多个具有负z-score的区域（z-score ≤ -2），表明这些区域具有高于随机序列的热力学稳定性，可能形成功能性的RNA结构。共识别出10个局部模体，主要位于RNA的5′和3′端，其中模体773-804和807-860 nt的z-score最低，提示它们可能具有重要的生物学功能。

Chemical Mapping of lncRNA-PAAN in vitro

在体外条件下，使用DMS、CMCT和NMIA对折叠后的lncRNA-PAAN进行化学修饰，发现多个高度可及的單鏈區域，例如78-84 nt、374-386 nt和791-805 nt等。这些区域与计算预测的功能模体位置高度一致，验证了lncRNA-PAAN具有模块化的结构特征。

Modular Folding and Conformational Dynamics of lncRNA-PAAN in vitro Revealed Through Integrative Chemical Mapping

结合化学测绘数据，RNAstructure预测了lncRNA-PAAN的全局和局部MFE结构。全局模型（ΔG°₃₇ = -414.0 kcal/mol）包含多个长程相互作用（如5–12/770–777 nt）和局部发夹结构。局部模型则识别出11个局部模体，其中4个发夹（163-280 nt、392-485 nt等）在全局结构中也得以保留。通过计算碱基配对概率和Shannon熵，发现多个区域（如46-102 nt、660-687 nt）具有高配对概率和低熵值，表明这些模体在体外环境中稳定存在。Rsample和IPANEMAP分析进一步揭示了RNA的结构动态性，表明lncRNA-PAAN采用了一种由稳定局部模体与柔性支架组成的半模块化架构。

Chemical Mapping of lncRNA-PAAN in the Cellular Environment

在IAV感染的A549细胞裂解液中进行的化学测绘显示，lncRNA-PAAN的修饰模式与体外实验相似，但存在一些差异，例如400-474 nt模体在细胞环境中显示出更高的Shannon熵，提示该区域可能参与蛋白质相互作用或具有结构可塑性。这些结果证实了lncRNA-PAAN在更接近生理的条件下仍能形成特定的二级结构。

Mapping in Cellular Environment Confirms the Modular Folding and Structural Dynamics of lncRNA-PAAN

基于细胞环境下的测绘数据，研究人员预测了lncRNA-PAAN的细胞MFE结构。与体外模型相比，细胞模型保持了多个关键模体（如46-102 nt、660-687 nt），但某些长程相互作用发生了变化。MEA模型与MFE模型高度相似，进一步支持了这些模体的可靠性。Shotgun方法（将RNA分成重叠片段进行测绘）证实了多个子域（如14-156 nt、806-861 nt）能够独立折叠，这与MALAT1、XIST等其他功能lncRNA的模块化组织原则一致。

Identified Structural Motifs of lncRNA-PAAN with High Fidelity

综合分析体外和细胞数据，研究人员鉴定出5个高置信度的结构模体：46-102 nt、194-205 nt、400-474 nt、660-687 nt和806-861 nt。这些模体在多种预测模型中重复出现，且具有高碱基配对概率，表明它们可能在IAV感染过程中发挥关键功能。

lncRNA-PAAN Secondary Structure Could Be Useful to Design Antivirals

为验证这些结构模体的功能重要性，研究人员设计了4条靶向单链区域的ASOs（例如ASO_PAAN_3靶向663-679 nt，ASO_PAAN_4靶向441-460 nt）。在IAV感染的A549细胞中，ASO_PAAN_3、4和5分别将病毒RNA水平降低了51%、57%和53%，并显著降低了lncRNA-PAAN的表达水平。而靶向双链区域的ASO_PAAN_2则无效果。细胞毒性试验表明这些ASOs在750 nM浓度下无毒性。进一步的化学测绘证实，ASOs通过空间阻遏（steric blockade）机制与靶标结合，并未改变RNA的整体折叠。

研究结论与意义

本研究首次全面解析了宿主lncRNA-PAAN的二级结构，揭示其在体外和细胞环境中均采用模块化架构，包含多个稳定的、功能可能至关重要的结构模体。这些模体（特别是400-474 nt、660-687 nt和806-861 nt）为IAV复制所必需。基于结构设计出的ASOs能有效沉默lncRNA-PAAN并抑制病毒复制，证明靶向宿主lncRNA的结构是一种可行的抗病毒策略。

该研究不仅增进了对IAV-宿主相互作用复杂性的理解，而且为开发针对宿主因子（而非易变异的病毒蛋白）的新型抗流感药物提供了概念验证和设计蓝图。未来，可进一步探究这些结构模体与病毒PA蛋白或其他宿主因子的具体相互作用机制，并优化ASOs的设计，以期推动其向临床应用转化。