细胞色素P450单加氧酶独特电子传递系统揭示真菌中链脂肪酸β-氧化新机制

本研究针对真菌代谢中链脂肪酸（MCFA）的机制难题，发现了一种天然融合蛋白CBBR（细胞色素b5与其还原酶的融合体），可高效传递电子至细胞色素P450 CYP540A2，实现对MCFA的β位立体选择性羟基化，并鉴定出配套的(R)-β-羟基脂肪酸脱氢酶（βHDH）。该系统构成了一条替代传统β-氧化的新代谢通路，在基因簇调控下帮助真菌耐受并降解毒性MCFA，为绿色生物制造提供了新策略。

　　

在微生物的世界中，脂肪酸不仅是构成细胞膜的重要成分，更是能量储存的关键物质。然而，中链脂肪酸（MCFA，通常指6-12个碳的脂肪酸）却是一把双刃剑——它们虽然可作为营养源，但其较强的脂溶性会破坏微生物的膜结构，抑制微生物生长。面对这一挑战，真菌进化出了怎样的代谢策略？传统观点认为，脂肪酸降解主要通过β-氧化途径完成，即脂肪酸先与辅酶A（CoA）结合形成酰基-CoA，再经过脱氢、水合、再脱氢和硫解等一系列步骤，最终生成乙酰-CoA。但这条途径需要消耗能量进行活化，且对游离脂肪酸的直接处理能力有限。

近年来，细胞色素P450（Cytochrome P450, P450）酶系因其强大的催化能力受到广泛关注。P450是一类含血红素的单加氧酶，能够活化分子氧，在底物分子中直接引入羟基，参与外源物解毒、固醇合成等重要生命过程。虽然已知某些细菌P450（如CYP152家族成员）可利用过氧化氢（H₂O₂）羟基化脂肪酸的α或β位，但依赖NAD(P)H和O₂、具有严格β位选择性的真核P450系统却未见报道。其电子传递系统更是多样且复杂，通常涉及黄素蛋白和铁硫蛋白等。在真菌模式生物构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，预测存在111个P450基因，但其绝大多数天然底物与生理功能仍是未知之谜。

由日本筑波大学可持续发展微生物学研究中心的Naoki Takaya教授领导的研究团队，深入探究了这一问题。他们发现，在构巢曲霉基因组中，一个名为CYP540A2的P450基因与一个编码FAD结合蛋白的基因（AN8920.4）相邻。深入研究揭示，AN8920.4编码的竟是一个罕见的天然融合蛋白：其N端是细胞色素b₅（Cyt b₅）结构域，C端是细胞色素b₅还原酶（Cyt b₅ reductase）结构域。这种细胞色素b₅-细胞色素b₅还原酶融合蛋白被命名为CBBR。这与已知的哺乳动物微粒体Ncb5or有相似之处，但后者生理电子受体不明，而本研究首次明确其功能是为P450提供电子。

研究人员通过异源表达纯化了CYP540A2和CBBR蛋白。光谱分析证实，CYP540A2具有典型的P450特征吸收峰，其还原态-CO复合物在444 nm有最大吸收。CBBR则同时显示出Cyt b₅（还原态在424, 527, 557 nm有吸收峰）和黄素辅基（在450-480 nm有吸收）的特征。酶动力学实验表明，CBBR偏好使用NADH作为电子供体，其催化效率（k_cat/K_m）比使用NADPH时高两个数量级。更重要的是，在NADH存在下，CBBR能有效地将电子传递给CYP540A2，形成还原态-CO复合物，证明CBBR是CYP540A2的生理氧化还原伴侣。两者甚至能以复合物形式被共纯化。AlphaFold3结构预测显示，两者通过界面上的静电相互作用（如CYP540A2的Arg179/Lys183与CBBR的Glu63等形成盐桥）紧密结合，CBBR的Cyt b₅结构域将其血红素辅基靠近CYP540A2近端面的血红素丙酸基团，为电子传递创造了最短路径。

那么，CYP540A2催化什么反应？底物筛选实验给出了答案。研究人员发现，CYP540A2-CBBR系统能羟基化碳链长度为7-12的饱和中链脂肪酸，主要产物经GC-MS鉴定为β-羟基脂肪酸，且其绝对构型为(R)型，光学纯度高达98%。对癸酸（DA, C10）的催化效率（k_cat/K_m）为6.0 × 10^-5 μM^-1 s^-1。相比之下，用内源NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）替代CBBR时，羟基化效率极低，凸显了CBBR系统的特异性。

脂肪酸如何被CYP540A2识别并实现β位特异性羟基化？通过氨基酸序列比对和突变研究，研究人员将目光锁定在保守底物识别位点SRS5和SRS6的Ser431和Gln542上。虽然将其突变为丙氨酸（Ala）并不显著影响底物癸酸的结合亲和力（K_d值变化不大），但却使催化速率常数（k_cat）和催化效率（k_cat/K_m）下降了一个数量级。AlphaFold3预测的底物结合模式显示，Ser431和Gln542的侧链与底物脂肪酸的羧基形成相互作用，从而将β碳原子定位在血红素铁附近，便于发生羟基化反应。一个预测的疏水隧道负责容纳并稳定脂肪酸的烷基链。这些结构特征共同决定了CYP540A2的底物特异性和区域选择性。

CBBR内部的电子传递有何独特之处？为了探究其融合域和连接区（linker region）的功能，研究人员构建了多种突变体：单独表达的Cyt b₅域（CB）、单独表达的还原酶域（BR）、以及缺失连接区的CBBR（CBBRΔL）。稳态动力学显示，融合的CBBR其电子传递效率远高于物理混合的CB+BR，说明域间融合有利于功能。更有趣的是，缺失连接区的CBBRΔL其胞内电子传递（NADH→FAD→Cyt b₅）速率大幅提升，但其支持的稳态羟基化反应却几乎停滞。通过停流光谱进行的预稳态动力学分析揭开了谜底：在野生型CBBR中，从NADH到FAD（k₁ = 5.4 s^-1）和从FADH₂到Cyt b₅（k₂ = 5.0 s^-1）的电子传递速率相近，而从还原型CBBR到CYP540A2的第一步电子传递（k₃ = 9.1×10^-3 s^-1）是限速步骤。连接区的缺失虽然加快了前两步，却破坏了其协调第二步电子传递或后续羟基化步骤的能力。结构预测表明，CBBR连接区的C端环状结构与CYP540A2的F-和G-螺旋相互作用，使其趋于“关闭”状态，缩小了底物通道体积，可能起到别构调节的作用，确保催化循环的顺利完成。

这条独特的P450β-羟基化通路在真菌生理中扮演什么角色？研究人员注意到，在CYP540A2和CBBR基因旁边，还有一个基因（AN8921.4）编码一个预测的FadB超家族蛋白，其具有N端3-羟基酰基-CoA脱氢酶和C端低密度脂蛋白受体YWTD结构域。功能实验证实，该蛋白是一个NAD⁺依赖的、高度立体选择性的(R)-β-羟基脂肪酸脱氢酶（βHDH），能催化(R)-βHDA氧化生成β-酮癸酸，其催化效率（k_cat/K_m = 0.20 μM^-1 s^-1）与已知的羟基酸脱氢酶相当。由此，一条崭新的β-氧化旁路通路被揭示：CYP540A2/CBBR将游离MCFA羟基化为(R)-β-羟基脂肪酸，βHDH再将其氧化为β-酮脂肪酸，后者是通用3-酮酸CoA转移酶的底物，可顺利进入经典的β-氧化流程。

基因表达分析证实，外源添加MCFA能显著诱导构巢曲霉中CYP540A2、CBBR、βHDH及一个预测的胞质3-酮酸CoA转移酶基因的表达（最高诱导46倍）。进一步地，敲除CYP540A2或CBBR基因会导致菌体内癸酸积累（分别增加1.5倍和4.9倍），尤其是在外源添加癸酸时，积累效应更为显著。这表明该通路在清除细胞内MCFA中发挥着关键生理功能。生长实验表明，C8-C10的MCFA及其β-羟基衍生物对真菌生长有抑制作用，因此，这条诱导性通路很可能帮助真菌适应并解毒高浓度的毒性MCFA。

生物信息学分析显示，由CYP540A2、CBBR、βHDH及其转录因子组成的基因簇在子囊菌门（Ascomycota）的662个真菌菌株基因组中广泛存在，包括133个Eurotiomycetes、38个Dothideomycetes、9个Sordariomycetes和1个Lecanoromycetes物种，其中 Aspergillus 和 Penicillium 属物种尤为丰富。这表明CBBR依赖的P450电子传递系统及其介导的β-氧化机制在真菌界具有广泛性和重要进化意义。

本研究综合运用了分子克隆与蛋白表达（于E. coli BL21系列菌株）、蛋白纯化（镍柱亲和层析）、紫外-可见光谱扫描、酶稳态与预稳态动力学分析（包括停流快速扫描光谱法）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析底物与产物、圆二色谱分析产物绝对构型、定点突变、定量PCR（qPCR）、基因敲除（于A. nidulans TN02A3菌株）及生物信息学分析（AlphaFold2/3结构预测、系统发育分析、基因簇搜索cblaster）等关键技术方法。

本研究结论与讨论部分强调，这项工作发现了一个前所未有的、依赖于细胞色素P450 monooxygenase的脂肪酸β-氧化机制。其独特性体现在四个方面：1. 独特的电子传递系统：鉴定出天然融合蛋白CBBR（Cyt b₅-Cyt b₅ reductase），它专一且高效地将NADH的电子传递给胞质P450 CYP540A2，扩展了P450电子传递系统的多样性。其连接区（linker region）不仅抑制了前期的电子传递速率，更对后续的催化步骤起到关键的别构调节作用，确保反应高效、特异地进行。2. 新颖的催化机制：CYP540A2使用Ser431和Gln542残基识别并结合底物羧基，实现对中链脂肪酸β碳的立体选择性(R)-羟基化，其机制不同于已知的H₂O₂依赖的P450过氧化物酶。3. 一条完整的替代代谢通路：该研究组装了从游离MCFA到β-酮脂肪酸的完整酶促反应链（CYP540A2/CBBR → βHDH），其特点是直接羟基化游离脂肪酸，无需先耗能形成酰基-CoA，且利用(R)-型中间体，最终通过β-酮酸汇入经典β-氧化，是传统途径的有效补充和 bypass。4. 重要的生理生态意义：该通路由MCFA诱导，通过清除细胞内积累的毒性MCFA，帮助腐生真菌适应环境，展现了P450酶系统在解毒和代谢适应中的核心作用。其基因簇在真菌中的广泛分布预示了其重要的进化意义。

该发现不仅深化了对真菌基础代谢的理解，更在合成生物学和绿色生物制造方面具有巨大应用潜力。(R)-β-羟基脂肪酸是合成表面活性剂、化妆品、药物及生物可降解塑料聚羟基脂肪酸酯（PHA）的重要手性前体。这种无需CoA活化、直接对游离脂肪酸进行手性羟基化的机制，以及可溶性酶系的特性，为简化生产工艺、高效合成这些高附加值化学品提供了极具吸引力的新工具酶和新策略。