嗜盐四联球菌天冬氨酸转运蛋白AspT的结构解析与电梯机制研究揭示新型次级交换转运分子机理

本研究针对次级转运蛋白底物交换分子机制不明确的问题，通过冷冻电镜和晶体学解析了嗜盐四联球菌AspT转运蛋白的apo外向开放状态和底物结合部分开放内向中间状态结构，发现其通过电梯机制(elevator mechanism)实现底物转运，该工作为理解AAEx家族转运蛋白功能机制提供了重要结构基础。

　　

在细胞生命活动中，化合物跨膜运输对维持细胞稳态至关重要。次级交换转运蛋白(secondary exchange transporters)利用电化学梯度储存的能量，逆浓度梯度介导各种底物的跨膜运动。然而，次级转运蛋白进行底物交换的分子机制至今仍不明确，这成为膜转运研究领域的重要科学问题。

乳酸菌嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)在酱油酿造中发挥重要作用：通过产生乳酸提供酸度，通过降低pH值改善酵母生长条件，通过维持弱酸性还原状态使酱油颜色更亮，并产生愉悦香气。研究发现，嗜盐四联球菌D10菌株通过电化学梯度将天冬氨酸转化为丙氨酸，细胞内产生的丙氨酸通过与细胞外天冬氨酸的产电交换而输出细胞，这一交换过程由天冬氨酸:丙氨酸交换转运蛋白(Aspartate:Alanine Exchanger, AspT)介导。

AspT属于天冬氨酸:丙氨酸交换器(AAEx)家族(转运蛋白分类数据库TC#2.A.81)，该家族转运蛋白在微生物中广泛保守，可运输多种底物。在嗜盐四联球菌中，通过L-天冬氨酸-4-脱羧酶(EC 4.1.1.12)催化的L-天冬氨酸脱羧偶联反应和天冬氨酸:丙氨酸反向转运蛋白(AspT)介导的产电天冬氨酸:丙氨酸交换反应产生质子动力(proton-motive force, PMF)。产生的PMF足够强大，可通过细菌FoF1-ATPase驱动ATP合成，这种PMF生成和ATP合成之间的相互作用被提出为质子代谢循环。

研究人员一直对嗜盐四联球菌AspT进行各种表征研究。使用蛋白脂质体的酶学分析表明，AspT对L-天冬氨酸的米氏常数较低，但对L-丙氨酸的米氏常数较高。AspT有10个跨膜(TM)区域和一个中央亲水环结构域，且该蛋白在底物结合时发生构象变化，表明AspT在结合L-天冬氨酸或L-丙氨酸时采用不同的构象。然而，AspT底物转运机制的细节，包括底物结合位点和底物转运途径，仍有待阐明。

AspT作为次级主动转运蛋白，其底物转运通过三种改变转运蛋白构象的机制之一实现：摇杆开关机制(rocker switch mechanism)、摇动束机制(rocking-bundle mechanism)或电梯机制(elevator mechanism)。在摇杆开关和摇动束机制中，转运蛋白的选定结构域充当移动屏障，交替阻断胞内或胞外侧的底物转运；而在电梯机制中，单个或多个结构域保持静止，携带底物结合口袋的转运结构域沿静止结构域移动，使底物转运结构域从细胞外侧显著转移到细胞内侧，或反之。

为了阐明嗜盐四联球菌AspT底物转运机制的细节，研究人员使用低温电子显微镜(cryo-EM)进行单颗粒分析(SPA)。他们首先使用稳定的L60C变体确定了AspT的外向开放apo形式，分辨率为3.56埃。此外，使用X射线晶体学以3.45埃分辨率确定了AspT-WT的apo结构。最后，使用cryo-EM确定了野生型AspT(AspT-WT)在L-天冬氨酸结合形式的结构，跨膜区域分辨率为3.40埃，可溶结构域分辨率为4.03埃。这些结构为嗜盐四联球菌AspT通过电梯型机制转运底物提供了令人信服的证据。

研究采用的主要技术方法包括：通过分子克隆构建AspT-WT及其变体的表达质粒；使用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达；采用镍亲和层析和凝胶过滤色谱纯化蛋白；利用等温滴定量热法(ITC)测定底物结合亲和力；通过悬滴气相扩散法进行蛋白质结晶；采用X射线晶体学解析结构；使用冷冻电镜单颗粒分析技术获得高分辨率结构；通过蛋白功能实验验证结构发现。

Cryogenic EM density map of apo AspT-L60C homodimer

研究人员通过冷冻电镜单颗粒分析确定了AspT-L60C的三维结构，使用金标准傅里叶壳层相关性(GSFSC)达到3.56埃分辨率，核心区域局部分辨率达到3.09埃。AspT形成同源二聚体，每个单体包含三个结构域：二聚化结构域(D-domain)、底物转运结构域(T-domain)和可溶结构域(S-domain)。两个T-domain位于D-domain的两侧，S-domain位于D-domain的细胞质侧。

每个原体有10个跨膜α螺旋(TM1-10)、两个螺旋发夹(HP1和HP2)和一个中央S-domain。每个螺旋发夹(HP)由两个短α螺旋(HP1a和HP1b或HP2a和HP2b)组成，通过环连接，从膜外进入，在膜内折返，再次返回外部。N端和C端都位于周质侧。

AspT有两种类型的重复基序。重复单元1包含N端D-1和T-1结构域，重复单元2包含C端D-2和T-2结构域。这些重复单元表现出显著的序列同一性(20%)，且重复单元1和2的结构可以通过在-179.4°旋转和0.96埃平移进行叠加，模拟伪C2对称性。

每个T-domain(T-1和T-2)由一个相对较长的α螺旋(分别来自TM4到TM5和TM9到TM10)和两个螺旋发夹(分别位于TM4和5之间的HP1，以及TM9和10之间的HP2)组成。每个D-domain(D-1和D-2)由三个相对较短的α螺旋(TM1-3, TM6-8)组成。D-1和D-2分别含有10个和5个苯丙氨酸残基，其中7个苯丙氨酸残基存在于二聚体界面，它们的芳香相互作用稳定了二聚体状态。

D-domain中的另外三个苯丙氨酸残基位于与T-domain的界面处，这些残基可能有助于配体结合时D-domain和T-domain的结构变化。在L60C变体中，TM3上替代的半胱氨酸残基位于二聚体界面，位置60的两个半胱氨酸残基近距离形成S-S键(2.0埃)，这支持了先前的研究报告。S-S键合的L60C变体有利于外向开放状态的结构。

与D-domain类似，S-domain也有二聚体界面。两个S-domain(S-1和S-2)具有相似的结构，每个都由两个α螺旋和三个β链组成。N端的S-domain 1(S-1)和S-domain 1'(S-1')产生亲水二聚体界面，而C端的S-domain 2和S-domain 2'不参与二聚体相互作用，S-1和S-2之间的间隙位于分子外部。S-domain相对于TM区域(T-domain和D-domain)的分辨率较差，表明S-domain经历了相对较大的结构域运动。

Crystal structure of the AspT-WT in an outward-facing conformation

通过等温滴定量热法(ITC)分析了L-天冬氨酸与DDM溶解的AspT-WT的结合，以确定解离常数(Kd)。相互作用是放热的，产生的放热热谱图显示结合曲线呈近乎理想的S形，且与化学计量比(N)接近1的情况良好拟合。L-天冬氨酸的解离常数(Kd)确定为0.21±0.02 mM。

研究人员从不同晶型中鉴定出各向同性衍射晶体，空间群为I42 2 2，这些晶体在使用月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)结晶添加剂时获得。使用9VEB_MolA(外向构象中的AspT-L60C)作为搜索模板，通过分子置换确定结构。不对称单元中存在单个AspT拷贝，并精修至3.45埃分辨率。与AspT-L60C叠加时，均方根偏差(rmsd)值为0.674，表明构象几乎相同。

如冷冻电镜结构所示，存在两个独立的接触区域：TM区域较大的一个和S-domain较小的一个。PISA测量显示，两个分子之间的总接触面积为2380.76埃2，其中TM区域和S-domain分别为1693.80埃2和686.96埃2。L60C突变使二聚体轴与生理二聚体轴对齐。

Structure of L-aspartate-bound conformation of the AspT-WT

接下来，研究人员挑战了存在L-天冬氨酸情况下AspT-WT的结构分析。为此，在L-天冬氨酸存在下纯化AspT-WT，并制备玻璃化网格用于冷冻电镜分析。

对TM区域和S-domain分别进行局部细化。TM区域的最终体积GSFSC分辨率为3.40埃，而S-domain的体积GSFSC分辨率为4.03埃。核心区域的局部分辨率对TM区域达到1.79埃，对S-domain达到3.60埃。结构域组织与apo L60C变体没有显著差异。然而，比较两个图谱发现，AspT-WT中S-domain的分辨率明显较低，表明AspT-WT的S-domain具有更大的灵活性。

密度图中的明确密度允许在两个亚基中模拟一个L-天冬氨酸分子，因此是L-天冬氨酸结合状态。基于密度图，将配体L-天冬氨酸建模到精修结构中。

在结合状态中，L-天冬氨酸位于HP1和HP2之间的口袋中，并与六个侧链相互作用：Thr130(HP1)、Ser132(HP1)、Tyr167(TM5)、Leu431(TM8)、Thr496(HP2)和Ser498(HP2)。对九个推定执行天冬氨酸/丙氨酸交换的AAEx成员进行的保守性分析表明，六个底物结合残基中的四个——Thr130、Ser132、Tyr167和Thr496——高度保守，表明它们在AAEx家族转运蛋白运输中起重要作用。

Substrate transport pathway in AspT

L-天冬氨酸结合导致构象变化。承载底物结合位点的两个螺旋发夹(HP1和2)具有不同的构象：在两个结构中，周质侧的发夹环区域(HP1)和细胞质侧的发夹环区域(HP2)靠近在一起。在D-domain中，三个Phe残基(位置66、69和434)排列成一行。在apo形式中，Phe66和Phe434位于细胞质腔附近，因此周质腔和底物结合位点在周质侧连接，作为门控残基。此外，Phe69靠近底物，并与Tyr524一起阻止底物从结合位点进入细胞质侧。这些结果表明，D-domain的L-天冬氨酸结合区域像滑动盖子一样打开和关闭底物结合位点的周质和细胞质腔。

为了研究L-天冬氨酸如何从周质腔进入底物结合位点，研究人员比较了apo和外向构象中底物结合位点周围的变化。在apo外向构象中，空的底物结合口袋可从周质表面溶剂接近，但底物结合口袋的细胞质侧关闭。在L-天冬氨酸结合形式中，底物结合口袋的周质和细胞质两侧都关闭，L-天冬氨酸存在于部分开放的内向中间状态(即L-天冬氨酸结合部分开放内向中间构象)。

在涉及底物结合的六个残基(Thr130、Ser132、Tyr167、Leu431、Thr496和Ser498)中，Tyr167位于从周质腔进入底物结合口袋的入口处。在L-天冬氨酸结合构象中，它与L-天冬氨酸形成氢键。Gly439(TM8)位于D-domain中，靠近Tyr167。在apo构象中，Gly439和Tyr167之间的距离为10.2埃。研究人员推断，增大G439的侧链会阻止L-天冬氨酸进入其结合位点。

为了研究L-天冬氨酸在apo外向开放构象中如何从周质腔进入底物结合位点，将Gly439替换为色氨酸。将变体纯化并重建到蛋白脂质体中，进行L-天冬氨酸转运试验。结果显示，G439W变体几乎完全丧失了L-天冬氨酸转运活性，表明Gly439在周质侧屏障形成中起关键作用。

Structural differences between the outward-open apo and L-aspartate-bound conformations

为了表征AspT底物转运中的三维构象变化，进行了准刚体旋转分析，比较了外向开放apo(AspT-WT)和L-天冬氨酸结合部分开放内向中间(AspT-WT)构象之间的差异。

当仅使用它们的D-domain叠加两个结构时，结合L-天冬氨酸导致T-domain向细胞质旋转13.3°，并有3.2埃的平移，而S-domain围绕膜的垂直轴旋转9.5°，有0.1埃的平移。这些结构变化表明，T-domain和S-domain作为刚体移动，而D-domain保持相对静止，支持电梯型机制。

这些结构和生化分析使研究人员提出了一个L-天冬氨酸转运机制模型。在外向开放apo构象中，L-天冬氨酸结合位点与周质腔连接，但D-domain和HP2在细胞质侧形成内部屏障，阻断底物结合位点与细胞质腔的连接。L-天冬氨酸与底物结合位点的结合诱导T-domain向细胞质旋转，D-domain向周质侧移动。相反，在L-天冬氨酸结合构象中，D-domain(TM3和TM8)和HP1在周质侧形成屏障，阻断底物结合位点与周质腔的连接。

虽然研究人员在蛋白质数据库中没有找到与AspT序列相似的同源转运蛋白，但发现几个具有与AspT的TM区域相似3D结构的转运蛋白。结构最相似的转运蛋白是肠沙门氏菌CitS。尽管它们的序列同一性相当低(12.2%)，但AspT和CitS具有整体相似的3D结构，平均模板建模(TM)分数为0.679，361个残基上的均方根偏差(RMSD)为4.53埃。AspT和CitS的二级结构拓扑非常相似。

在AspT的L-天冬氨酸结合构象中，L-天冬氨酸进入细胞质侧的途径被F69和Y524阻断，表明这是在向内开放之前的部分开放内向中间构象。重要的是，如果AspT的T-domain向细胞质额外旋转10°，底物结合位点将与细胞质腔连接，L-天冬氨酸将被释放到细胞质腔中。尽管AspT向内开放构象的结构仍有待阐明，但研究人员推断这是L-天冬氨酸转运机制最可能的情况。

研究结论与讨论表明，这项工作通过解析嗜盐四联球菌天冬氨酸:丙氨酸交换器AspT的结构，阐明了次级交换转运蛋白底物交换转运的机制。研究人员获得了AspT在两种离散构象下的结构：apo外向状态和底物L-天冬氨酸结合部分开放内向中间状态，分别来自稳定的L60C变体和AspT-WT。此外，通过X射线晶体学阐明了AspT-WT的apo外向状态。

分析表明，携带一个L-天冬氨酸分子的转运结构域T-domain向膜的细胞质侧移动，并形成外部屏障，阻断周质对底物结合口袋的访问。这些结果支持AspT通过电梯机制转运L-天冬氨酸的观点，其中T-domain的上下移动是关键步骤，而D-domain是静止的，支持承载底物的T-domain滑动并参与形成移动屏障。

当叠加HP结构时，T-domain中的所有结合残基都良好对齐。相比之下，静态D-domain位移约7-8埃。当叠加静态D-domain时，T-domain中的结合残基也移动约7-8埃。这一观察支持电梯型构象变化。两种结构的表面表征显示每种情况下都存在屏障(溶剂不可接近的区域)，内部屏障更为明显，表明外向构象可能更稳定。

当研究人员使用AspT S-domain的结构在蛋白质数据库中探索相似的3D结构时，发现AspT是唯一具有S-domain的转运蛋白，而类似的S-domain结构存在于通道和其他与环状di-AMP结合的蛋白质中。这些结果表明，虽然CitS具有与AspT相似的底物转运机制，但在底物转运机制的调节方面也存在差异。研究人员推测，S-domain的存在可能是差异的基础，这必须通过AspT和CitS的结构比较进一步阐明。

AspT和CitS底物结合位点的结构比较显示，AspT和CitS的HP2位置相似，而HP1的位置在倾角和位置上有所不同。AspT和CitS之间观察到的另一个差异是，在CitS中观察到的HP1和HP2之间的Na+衍生密度在AspT中未观察到，这与AspT不转运Na+的事实一致。

在AspT中，两个S-domain似乎响应构象变化而在膜内进行横向旋转，方式与TM区域中观察到的结构重排相协调。值得注意的是，与CitS不同，AspT具有参与单体间相互作用的S-domain，表明两个原体以协调和协作的方式发挥作用。

该研究揭示了AspT的整体结构和L-天冬氨酸的转运机制，但L-丙氨酸结合结构尚未获得，L-丙氨酸的结合位点仍未确定。先前的生化研究表明，L-丙氨酸的结合诱导了与AspT中L-天冬氨酸结合状态不同的构象。未来对AspT的L-丙氨酸结合结构的阐明将增强对AspT底物交换转运机制的理解。这项研究为理解维持生物体稳态至关重要的次级交换转运蛋白的底物交换转运机制提供了重要见解，特别是通过电梯机制进行的次级交换转运。

该研究成果发表在《Communications Biology》期刊上，为理解膜转运蛋白工作机制提供了重要结构基础，对生物技术领域的转化应用具有重要价值。