质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-9和mcr-10在Inc型质粒骨架间的传播动力学及其全球传播特征研究

本研究针对多重耐药革兰阴性菌最后一道防线——黏菌素的耐药性问题，聚焦移动耐药基因mcr-9和mcr-10的流行病学传播机制。研究人员通过基因组学与系统发育分析，揭示了这些基因通过多样Inc型质粒在全球范围内的传播规律，发现其常与氨基糖苷类、四环素类和甲氧苄啶耐药基因共现，为制定针对性公共卫生干预策略提供了关键科学依据。

　　

随着多重耐药和碳青霉烯类耐药革兰阴性菌引发的致命感染日益增多，多黏菌素类抗生素黏菌素（colistin）已成为临床治疗的最后防线。这种阳离子多肽通过破坏细胞质膜上的脂多糖层，增加膜通透性导致细胞内容物泄漏，最终引起细胞死亡。尽管早在1947年就被发现，但由于肾毒性和神经毒性等副作用，黏菌素在1970年代曾退出临床使用。然而面对耐药菌感染的严峻形势，21世纪初它又被重新启用作为挽救治疗手段，同时在畜牧养殖和水产养殖中持续数十年被用作治疗和预防药物。

然而黏菌素耐药性的出现特别是肠杆菌目细菌中的耐药现象令人担忧。传统认为黏菌素耐药主要与染色体突变有关，涉及pmrAB、phoPQ、ccrAB、lpxACD或mgrB等基因的调控变化。2016年情况发生重大转变——中国从规模化养殖猪中分离的大肠杆菌首次发现质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，这是一种磷酸乙醇胺脂质A转移酶。目前全球已报道十个不同的mcr基因家族（mcr-1到mcr-10），其中mcr-9和mcr-10是最新发现的成员。

mcr-9基因于2019年在对沙门氏菌基因组的计算机筛选中首次被发现，该基因位于IncHI2质粒上，源自2010年美国患者分离的鼠伤寒沙门氏菌血清型菌株。实验证明将mcr-9导入敏感大肠杆菌后可诱导耐药性表达，其调控与qseB/C双组分调控系统相关。相反，一些携带mcr-9的沙门氏菌和大肠杆菌菌株仍对黏菌素敏感，这与缺乏qseB/C调控基因有关。mcr-10最初在中国医院的罗氏肠杆菌临床分离株中被鉴定，由IncFIA质粒携带，能使克隆菌株的黏菌素最低抑菌浓度（MIC）提高4倍。基于蛋白质二级结构的相似性，推测mcr-9和mcr-10可能起源于共同祖先。

尽管已有研究在阴沟肠杆菌复合体中发现mcr-9和mcr-10的高流行率，且常与碳青霉烯酶基因共存，但对这些基因在不同细菌分类群中的质粒遗传背景了解仍然有限。为此，研究人员对美国达特茅斯-希区柯克医疗中心（DHMC）血流感染分离的肠杆菌属菌株进行深入研究，结合全球质粒数据集分析，旨在阐明mcr-9和mcr-10的传播特征和耐药基因共现模式。

研究人员采用Illumina短读长和Oxford Nanopore长读长测序技术对59株肠杆菌分离株进行全基因组测序，通过杂交组装获得高质量基因组。使用Bactinspector和Type Strain Genome Server进行物种鉴定，通过平均核苷酸一致性（ANI）界定物种边界。采用MLST进行序列分型，利用PlasmidFinder鉴定质粒复制子类型，NCBΙ AMRFinderPlus鉴定耐药基因。通过MobileElementFinder分析移动遗传元件，使用ReGAIN进行耐药基因共现性分析。全球质粒数据来自PLSDB数据库，包含59,895个完整质粒组装体。

四个物种的血流来源肠杆菌携带移动性mcr-9和mcr-10

59株菌株鉴定为8个物种，其中9株菌携带mcr-9.1或mcr-10.1，涉及阿斯伯里肠杆菌、科贝肠杆菌、霍马切肠杆菌和罗根坎普肠杆菌。系统发育分析显示这些菌株分属8个ST型，与无mcr菌株具有明显遗传差异。耐药基因分析显示除mcr基因外，这些菌株还携带β-内酰胺酶基因（blaACT、blaMIR）、磷霉素耐药基因fosA和喹诺酮耐药基因oqxAB。

mcr-9和mcr-10变体通过多样化Inc型质粒在全球细菌物种中传播

全球数据集分析显示，326个质粒来自13个属的细菌，主要集中于肠杆菌属（59.81%）、沙门氏菌属（11.34%）、克雷伯菌属（10.73%）和柠檬酸杆菌属（6.74%）。这些质粒携带mcr-9.1（60.73%）、mcr-9.2（18.40%）和mcr-10.1（14.41%）等变体。92.02%的质粒含有两个或多个融合复制子，其中IncHI2A-IncHI2-pKPC-CAV1321三复制子质粒最为常见（71.77%）。质粒移动性预测显示89%为接合型，表明具有高水平传播潜力。

携带mcr-9或mcr-10的质粒在长度和AMR基因携带方面存在差异

不同复制子类型的质粒大小存在显著差异，IncHI2A-IncHI2-IncR-pKPC-CAV1321组质粒中位大小最大（349 kbp），而单复制子质粒IncFIA(HI1)最小（68 kbp）。AMR基因数量也因复制子类型而异，多复制子质粒携带的AMR基因数量显著多于单复制子质粒。移动遗传元件分析显示，53.37%的质粒同时携带转座子和整合子，18.71%的质粒同时存在插入序列、转座子和整合子三种元件。

质粒携带的AMR基因与mcr-9或mcr-10等位基因的共现性

多变量分析显示AMR基因形成三个 distinct 簇，每个簇代表倾向于在同一质粒中共现的AMR基因集合。mcr-9.1与qnrB4（喹诺酮耐药）、blaDHA-1（头孢菌素耐药）和aph(3')-Ia（氨基糖苷类耐药）基因紧密聚类，而mcr-9.2与blaCTX-M-9（头孢菌素耐药）和ant(2")-Ia（氨基糖苷类耐药）基因 proximity更近。贝叶斯网络分析揭示了AMR基因与mcr等位基因之间的概率共现关系：mcr-9.1与其他AMR基因具有高条件概率但相对风险低，而mcr-9.2则表现出低条件概率但高相对风险值。

研究结论表明，mcr-9和mcr-10变体通过多样化的Inc型质粒在全球范围内广泛传播，这些质粒具有不同的复制子类型和遗传结构，且大多数被预测为接合型或可移动型，显示出跨菌种和生态位传播的巨大潜力。质粒介导的mcr基因常与其他抗菌剂耐药基因（特别是氨基糖苷类、四环素类和甲氧苄啶类）共现，这种共选择现象可能进一步限制临床治疗选择。

讨论部分强调，质粒共整合（多复制子质粒）可能是mcr携带质粒在病原体群体中多样化和增殖的重要机制。根据Sykora 1992年假说，在质粒共整合体中，一个复制子保持高度保守，而另一个不再受强选择压力，能够更自由地积累突变，这既促进了质粒多样化，也增加了质粒分类和进化关系分析的复杂性。多复制子质粒可能通过减轻不相容性问题提高宿主内稳定性，促进与更广泛细菌宿主的相互作用，并保留亲本质粒的遗传元件，成为传播抗菌素耐药性、毒力和其他增强细胞适应性基因的重要载体。

这些发现为了解mcr-9和mcr-10的质粒背景提供了重要见解，对设计有效的公共卫生策略和针对性干预措施以保护最后一道抗菌防线具有重要意义。随着mcr基因家族的不断增多和等位变体的快速进化，持续监测和深入研究对于应对黏菌素耐药性的全球健康威胁至关重要。