蛋白质设计新突破：诱导解离机制实现细胞因子信号传导的精准时序调控

本期推荐一项蛋白质设计领域的重要突破。为解决蛋白质相互作用中高亲和力与快速解离难以兼得的矛盾，研究人员开发了"促进解离"（facilitated dissociation）的创新设计策略。通过构建应变激发的三元复合物中间态，成功实现了效应子诱导的蛋白复合物解离速率最高提升5,700倍。该技术成功应用于IL-2信号通路的时序精准调控，为研究细胞信号转导动力学提供了强大工具。

　　

在生命活动的精密调控中，蛋白质之间的相互作用犹如一场精心编排的舞蹈，既需要紧密的结合以确保信号传递的特异性，又需要及时的分离以实现快速的响应调控。然而，这两个要求往往相互矛盾：高亲和力的相互作用通常意味着缓慢的解离速率，而快速的交换则需要较快的解离速率。这种固有的矛盾限制了科学家们对生物过程进行精确时空调控的能力。

自然界中存在一种称为"促进解离"（facilitated dissociation）的巧妙机制，即一个效应分子（effector）能够结合到靶标-宿主（target-host）复合物上，形成激发态的三元复合物，从而加速靶标的解离。这种现象在DNA系统中（如链置换反应）已经得到了广泛应用，但在蛋白质系统中，由于结构的复杂性和动态性，一直缺乏通用的设计方法。

为了解决这一挑战，来自多个研究机构的科学家们在《Nature》杂志上报道了一项突破性研究。他们开发了一种全新的蛋白质设计策略，通过精心设计应变激发的中间态，实现了效应子诱导的蛋白质复合物解离速率的大幅提升，最高可达5,700倍。这一技术不仅为构建快速生物传感器和动力学控制电路提供了新工具，更重要的是，它使得科学家们能够以前所未有的时间分辨率来解析白细胞介素-2（IL-2）信号传导的时序动力学。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先利用蛋白质设计软件（包括RFdiffusion、RosettaFold和ProteinMPNN）设计了一系列构象开关与结合蛋白的融合体；通过表面等离子共振（SPR）技术详细表征了蛋白质相互作用的动力学参数；运用X射线晶体学解析了多个状态下的蛋白质三维结构；采用双电子-电子共振（DEER）光谱和分子动力学（MD）模拟研究了三元复合物的动态构象变化；最后通过单分子荧光成像和荧光共振能量转移（FRET）技术在活细胞中验证了设计蛋白的功能。研究使用了工程化细胞系（HeLa和YT-1）以及原代人T细胞作为实验模型。

设计策略与机制验证

研究人员首先设计了一种效应子响应的构象开关（hinge protein cs221），将其与一个模型结合蛋白-靶标对（LHD101）进行融合。设计的关键在于：当效应子不结合时，靶标可以正常结合；而当效应子结合后，开关会发生构象变化，与靶标产生空间冲突，形成应变的三元复合物，最终导致靶标解离。

最初的设计（AS0）采用构象选择机制，即开关必须先过渡到开放状态Y，然后效应子才能结合。但由于状态Y与靶标存在冲突，当靶标结合时，这种构象变化很慢，限制了效应子结合的速率和整体促进解离的速率。

为了克服这一限制，研究人员开发了诱导拟合机制的新开关。这些新开关在状态X和整个构象转变过程中都保持开放的效应子结合裂隙，允许柔性效应子结合。这种机制类似于动力蛋白的"动力冲程"（power stroke），效应子结合后发生折叠，形成更多的相互作用，驱动构象转变。

动力学特性表征

研究人员对最佳设计（AS1）进行了详细的动力学表征。表面等离子共振（SPR）实验显示，在没有效应子时，靶标从宿主解离很慢；加入效应子后，解离速率显著增加。

通过比较柔性肽效应子和刚性三螺旋束（3hb）效应子，研究人员发现了两者不同的作用机制。刚性3hb只能结合到AS1的完全开放状态Y，TH_X→TH_Y构象变化较慢，成为速率限制步骤。而柔性肽效应子可以结合到状态X的AS1，通过诱导拟合机制加速构象变化。

结构生物学证据

X射线晶体学结构为设计提供了直接证据。AS1和AS5系统的单独宿主以及宿主-效应子复合物的晶体结构与设计模型高度吻合（最大Cα均方根偏差为1.3?）。

更重要的是，研究人员解析了AS1在靶标和效应子共存的三元复合物中间态的结构。在两个不同的晶体结构中，开关区域与状态Y的设计模型密切匹配，而结构的其余部分通过多种方式应变来解析同时结合靶标和占据状态Y所带来的结构挫折（frustration）：结合蛋白融合弯曲、与开关直接冲突的靶标部分变得无序、靶标在其界面处扭曲，破坏了界面疏水包装和剪切了界面链配对。

解离加速的调控

研究人员通过调节三元复合物中的应变能来优化解离动力学。他们采样了多种靶标+结合蛋白相对于开关的位置，重建了开关与新定位的结合蛋白之间的融合，并选择了预测具有跨越不同方向的大量变形的变体。

这些对融合区域的改变，尽管远离两个结合位点，引起了靶标解离动力学及其受效应子调节的显著变化。通过比较预测的变形与向前和向后方向的促进解离速率，研究人员发现三元复合物的全局应变能取决于变形的大小和方向，并且应变可以非均匀地分布在整个结构中，导致动力学不对称。

应用展示

研究人员展示了促进解离在构建以前设计无法实现的动力学行为的蛋白质系统方面的应用能力。

首先，受DNA中链置换反应的启发，他们创建了一个动力学陷阱系统，在刺激后通过链式反应快速重新配置。他们将效应子肽（E2）与靶标融合，使得E2在被宿主结合时被遮蔽。正如预期的那样，E2-靶标从AS114的释放和随后H2的切换是缓慢的，但在加入原始效应子后显著加速。

其次，他们证明了设计可以补充具有高亲和力的分裂蛋白系统，并使它们能够快速关闭。他们将AS1和靶标用NanoBiT分裂荧光素酶片段标记，当加入效应子和过量未标记靶标时，荧光素酶活性消失得比仅加入过量未标记靶标时快得多。

第三，他们开发了基于促进解离的快速传感器。通过将SmBiT肽封装在与宿主结合的效应子中，靶标结合后的促进解离（与之前相比反向）迅速释放SmBiT，使荧光素酶重组。使用这种策略与设计的SARS-CoV-2受体结合域（RBD）结合蛋白（LCB1），他们生成了16个"AScov"传感器设计，其中RBD在状态Y与开关冲突，但在状态X不冲突。加入SARS-CoV-2 RBD后，最佳传感器显示荧光素酶活性增加30倍，半时间为30秒，比之前依赖构象选择的LOCKR-based SARS-CoV-2传感器快70倍。

IL-2信号传导的快速调控

最令人印象深刻的应用是对细胞过程的高时间分辨率控制。在细胞信号传导中，配体在其同源受体上的停留时间被认为调节信号传导和细胞反应。中央免疫细胞因子白细胞介素-2（IL-2）通过诱导β和γ_c链的异源二聚化来激活IL-2受体（IL-2Rβγ_c）。由此产生的复合物在数小时的时间尺度上解离或降解，因此控制IL-2信号传导的时间动力学是困难的：没有关闭开关。

研究人员构建了一个可切换的IL-2模拟物，能够以秒的时间分辨率控制IL-2Rβγ_c复合物的寿命。他们采样了多种γ_c相对于AS1开关的位置，将Neo2（一个先前设计的IL-2模拟物）刚性融合到开关上，使得在状态X，γ_c可以结合，但在效应子结合的状态Y，它会强烈冲突。

他们鉴定了几个设计，其中效应子结合显著加速了γ_c从活性信号传导复合物的解离。对于其中一个设计ASNeo2，效应子结合诱导γ_c解离速率增加1,500倍。他们设计了具有不同解离动力学和针对降解的拓扑保护的ASNeo2变体；对于其中一个，效应子加速γ_c解离5,700倍，这是所有设计系统中最高的倍数变化。

为了研究ASNeo2在生理系统中的切换能力，他们通过单分子荧光显微镜量化了标记的IL-2Rβ和γ_c在活细胞质膜中的二聚化。双色共跟踪和迁移率分析证实，ASNeo2有效二聚化IL-2Rβ和γ_c，并且加入效应子后快速且完全地逆转这种关联，即使在γ_c高过量的情况下也是如此。通过在相对两侧标记ASNeo2，他们可以使用单分子荧光共振能量转移（smFRET）在质膜上观察效应子诱导的分子内构象变化。

ASNeo2在人类自然杀伤（NK）细胞（YT-1细胞系）中激活信号传导，并且在效应子存在下其活性大大降低。加入效应子后，STAT5磷酸化立即停止积累并逐渐降低到低水平。效应子阻断ASNeo2活性的效果几乎与ruxolitinib（一种JAK1抑制剂）一样有效。

为了检查IL-2信号传导的持续时间如何影响下游细胞反应，他们用ASNeo2刺激原代人T细胞，并在不同时间点诱导解离。虽然持续刺激是增殖所必需的，但短暂的瞬时刺激后明显避免了凋亡：用ASNeo2处理然后在5分钟后加入效应子的细胞在三天后的存活率是未刺激对照的两倍，尽管大多数下游IL-2靶蛋白被抑制。这可能反映了瞬时刺激后caspase-3活性降低和BCL2表达增加。

为了进一步研究IL-2信号传导对信号传导复合物寿命的依赖性，他们比较了用ASNeo2短暂、持续或未处理的T细胞的RNA测序（RNA-seq）数据。短暂刺激（通过与ASNeo2孵育然后效应子诱导解离）上调了参与抑制凋亡（BCL2、NIBAN2和RNF157）、细胞周期调控（CDKN2B、CDK6、CCND2和PIM1）、抑制细胞因子信号传导（SOCS2和CISH）和免疫激活（TNFSF8、HAVCR2和PTGER2）的基因。在激活时，T细胞通常将其能量生产从氧化磷酸化转变为糖酵解，他们观察到短暂刺激下调了氧化磷酸化基因（糖酵解基因尚未上调）。持续刺激激活了与mTORC驱动的代谢变化和MYC-和E2F驱动的细胞周期进展相关的基因（例如CDK4和POLD2），但短暂刺激没有，表明IL-2信号传导必须持续才能通过G₁/S检查点。短暂刺激确实激活了与有丝分裂纺锤体形成相关的基因（例如DOCK2和KIF1B），表明在T细胞激活后立即进行有丝分裂的准备，在细胞周期检查点之前。

研究结论与意义

这项研究展示了通过在设计耦合蛋白质系统时明确考虑激发中间态，可以设计出广泛的促进解离系统。研究人员使用可切换的靶标结合蛋白（宿主）和柔性效应子，这些效应子可以快速结合并切换靶标-宿主复合物，诱导与靶标的大空间冲突，形成应变的激发三元复合物。通过调节三元复合物的应变能，可以调整靶标解离的加速效果。

晶体结构在整个促进解离过程中证实了设计激发态和大注册位移构象变化的能力。设计的动态系统显示出高动态范围和快速刺激响应，证明了促进解离相对于相互排斥竞争的动力学优势。

动力冲程机制可以比棘轮机制更有效地产生力。诱导折叠是驱动蛋白动力冲程的基础，他们的柔性效应子可能也在结合时折叠，通过降低能垒加速构象转变：沿转变坐标的上坡步骤的能量成本可以通过与折叠肽形成额外的相互作用来补偿。与柔性效应子的这种诱导拟合机制相比，他们发现刚性效应子即使结合更紧密，提供的速率加速也减少。在驱动蛋白和其他生物系统中，很难直接评估结合时的灵活性和折叠在整体功能中的作用；相比之下，他们设计的模型系统允许直接比较柔性和刚性效应子，并表明前者在对抗负载时产生更快的构象转变。

大多数已知的促进解离例子通过直接空间重叠和复杂的变构结合靶标和效应子。相比之下，由于他们切换空间冲突的变构机制对结合蛋白或靶标没有特定要求，他们的方法可以相当普遍地用于动态调节蛋白质-蛋白质相互作用：通过融合到他们的开关，几乎任何结合相互作用都可以在效应子存在下快速关闭。

他们的方法立即转移到快速切换活性IL-2样信号传导复合物：他们在第一次尝试中就获得了几个可行的设计（测试了24个设计）。用这种可切换的细胞因子控制IL-2信号传导的持续时间可以研究信号传导的早期事件或通过时间敏感的调控机制进一步下游调整细胞反应（例如，破坏细胞表面或后期内体中的信号传导复合物可以用于区分由每个区室引起的细胞反应）。在治疗上，效应子的全身给药和可切换细胞因子的局部给药可以仅在给药部位引发强烈的免疫激活（因为任何逃逸到循环中的细胞因子都会被效应子失活）。更广泛地说，他们的工作为设计蛋白质运动和变化的速率和途径提供了一条途径，这最终应该能够构建复杂的、类似生命的蛋白质机器。