凝聚态蛋白质的集体稳态调控：mRNA介导的核内相分离新型反馈机制——interstasis的发现

本文揭示了一种称为"interstasis"的新型稳态机制，该机制通过RNA-蛋白质凝聚体（nuclear speckles）选择性捕获自身mRNA，实现对固有无序区域（IDR）蛋白的集体负反馈调控。研究发现遗传密码结构和保守密码子偏好确保了低复杂度结构域（LCD）与多价RNA区域的编码对应关系，其中精氨酸富集的混合电荷结构域（R-MCD）由mRNA中重复的嘌呤富集序列编码。该机制涉及TRA2蛋白的重新定位和CLK激酶介导的磷酸化修饰，为理解核内凝聚体（biomolecular condensates）的剂量敏感性调控提供了新范式。

　　

广义RNA多价性评分识别编码低复杂度结构域的密码子偏好性多价区域

研究人员开发了广义RNA多价性（GeRM）评分算法，用于量化转录本中相似k-mer的聚集程度。该算法通过计算每个k-mer与周围k-mer的序列相似性（加权距离函数），识别出高度多价的RNA区域。分析显示，人类蛋白质编码基因的编码序列（CDS）中存在显著的多价区域，这些区域与低复杂度结构域（LCD）的编码密切相关。例如，LUC7L3基因的mRNA包含一个GA富集的GeRM区域，该区域专门编码带电氨基酸。

研究发现，GeRM区域编码的氨基酸序列熵值显著低于蛋白质其他区域，且AlphaFold2预测表明这些区域倾向于形成固有无序区域（IDR）。密码子洗牌实验证实，LCD编码区域的RNA多价性受到密码子使用偏好的强化，特别是在精氨酸等氨基酸的密码子选择上。进化分析表明，增强多价性的密码子选择在脊椎动物中高度保守，提示存在功能选择压力。

密码子偏好促进RNA多价性

精氨酸密码子使用分析揭示了两种不同的偏好模式：GA富集型（AGA、AGG、CGA）和CG富集型（CGG、CGC）。GA富集型密码子倾向于编码带正电荷的混合电荷结构域（R-MCD），而CG富集型则更多编码富含脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸的LCD。这种密码子偏好与蛋白质功能密切相关：GA富集型R-MCD蛋白显著富集在核斑点和RNA结合相关功能中。

跨物种比较显示，这种密码子偏好模式在羊膜动物（爬行动物、鸟类和哺乳动物）中最为明显，而在两栖动物和更早分支的物种中较弱，表明在陆地脊椎动物进化过程中逐渐强化。

CDS多价性与LCD类别的关联

通过UMAP降维和聚类分析，研究人员将GeRM区域分为多个功能类别：GA富集型（进一步分为腺嘌呤偏倚、鸟嘌呤偏倚和胞嘧啶掺杂亚型）、GC富集型、CAG重复型和C富集型等。每种类别编码特定类型的LCD，并与不同的生物学功能相关：GA富集型主要与核RNA调控和染色质相关功能有关；GC富集型与转录因子相关；C富集型与SH3结构域和肌动蛋白结合相关。

R-MCD具有独特的密码子偏好

精氨酸密码子使用分析表明，R-MCD可分为GA富集型和CG富集型。GA富集型R-MCD富含带电氨基酸残基，包括典型的R-MCD，而CG富集型则含有更多脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸。功能分析显示，GA富集型R-MCD基因显著富集核斑点定位、mRNA加工和RNA结合等Gene Ontology术语。

R-MCD剂量驱动GA富集mRNA的捕获

为研究R-MCD蛋白积累的效应，研究人员构建了可诱导表达PPIG蛋白LCD结构域（PPIG_LCD）的HeLa细胞系。表达PPIG_LCD导致核斑点数量减少、体积增大，但不影响SC35染色强度，这与R-MCD增强斑点凝聚性的已知效应一致。

核质分离测序显示，PPIG_LCD表达随时间增加导致GA富集多价mRNA在核内显著滞留，且滞留程度与GA多价性评分正相关。脉冲SILAC实验证实，GA富集mRNA的核滞留导致其编码蛋白的合成减少。

通过HCR-FISH技术直接观察，发现PPIG_LCD表达以剂量依赖方式促进五种GA富集多价mRNA（而非对照mRNA）在核斑点中的滞留。这种效应也出现在其他R-MCD蛋白（LUC7L3、PRPF38B和SRSF11）过表达时，但对其他类型LCD蛋白不敏感。定量分析表明，细胞总R-MCD蛋白丰度增加15%即足以诱导选择性mRNA滞留。

凝聚倾向蛋白的协同调控

研究人员通过密码子工程改造LUC7L3的R-MCD编码序列，创建了GA多价性高/低但GC含量相同的版本。当这些序列作为mGreenLantern报告基因的3'UTR时，高GA多价性版本在PPIG_LCD表达时呈现更强的表达抑制，证实了mRNA多价性在介导互稳态中的核心作用。

核滞留mRNA编码的蛋白质具有显著特征：富含IDR、带电荷氨基酸比例高、结构无序性强。这些基因在功能上富集核斑点、染色质重塑、RNA结合和加工等术语，且具有双向剂量敏感性（单倍体不足和三倍敏感）。gnomAD数据分析显示，这些基因具有更高的突变限制性，DosPS评分也表明其相分离倾向更强。

外显子密度抵消GA多价性

研究人员通过随机森林建模发现，CDS长度、平均外显子长度、GA富集和CAG富集多价性四个特征最能预测mRNA在互稳态中的核滞留响应。其中CDS长度预测能力最强（AUROC=0.83），其他特征进一步改善模型性能。

外显子连接复合体（EJC）沉积可能限制多价RNA序列的可及性。分析表明，靠近EJC结合区域的GA富集多价序列其核滞留能力较弱。为验证这一假设，研究人员设计了精巧的报告基因库系统：保持CDS长度和GC含量恒定，但通过组合装配实现GA多价性和内含子数量（1-8个）的正交变化。

长读长测序证实所有内含子均被有效剪切。报告基因分析显示，高GA多价性转录本的核滞留程度随PPIG_LCD表达时间增加而增强，且与外显子数量负相关：外显子少（外显子长）的转录本核滞留显著，而外显子多（外显子短）的转录本即使GA多价性高也不易滞留。这表明EJC介导的mRNP包装可抵消多价RBP组装的作用。

TRA2蛋白介导互稳态

通过分析报告基因序列与RBP结合潜能的相关性，发现GA多价性与核斑点蛋白TRA2A（r=0.97）和TRA2B（r=0.95）的结合潜能高度相关。公共CLIP数据分析表明，34种RBP偏好结合多价环境中的靶motif，其中GA富集GeRM区域被多种核斑点RBP结合，尤以TRA2蛋白富集程度最高。

TRA2B iCLIP实验证实其强烈结合CDS中的GA富集GeRM区域，且结合位点常包含剪接连接点，表明TRA2B在剪切后仍与多价位点结合。虽然TRA2蛋白以调控选择性剪切闻名，但互稳态相关的GA多价外显子在不同组织中均为组成型外显子，且TRA2敲除不影响其包含性。

重要的是，TRA2B的亚细胞定位受R-MCD剂量调控：在无PPIG_LCD表达时弥散分布于核质，随PPIG_LCD表达增加而逐渐富集于核斑点。TRA2A/B双敲除实验证明，在低PPIG_LCD水平下，TRA2蛋白是GA富集mRNA斑点滞留的主要效应器；而在高R-MCD浓度下，其他RBP也可能参与这一过程。

通过构建LUC7L3 R-MCD的密码子工程版本，发现只有当R-MCD作为蛋白质表达时才驱动TRA2B重定位，作为3'UTR序列时无此效应，证实是R-MCD蛋白质而非其mRNA驱动了TRA2B的重新定位。

CLK激酶调控互稳态

SR蛋白的核内分布受CLK激酶家族磷酸化调控。使用选择性CLK抑制剂（CLK-IN-T3）处理细胞导致TRA2B和其他SR蛋白去磷酸化，引发TRA2B强烈重定位至核斑点，并伴随轻微的整体poly-A⁺ mRNA核滞留增加。长期CLK抑制导致核斑点变大、数量减少。

HCR-FISH显示，CLK抑制特异性增加GA富集mRNA（如EIF3A、BRD4）在斑点中的滞留，而对对照mRNA无影响。报告基因实验证实，CLK抑制以序列特异性方式增强GA多价转录本的核滞留。转录组分析表明，CLK抑制与R-MCD过表达引起的mRNA核滞留模式高度相关。

讨论

本研究发现的互稳态机制代表了通过蛋白质-RNA凝聚体实现集体反馈调控的新范式。核斑点作为传感器，通过选择性捕获mRNA调控最具剂量敏感性的凝聚倾向蛋白的表达。这种调控依赖于遗传密码的结构特征——物理性质相似的氨基酸具有相似密码子，且密码子偏好进一步强化了这种对应关系。

CLK激酶活性受细胞周期进程和温度变化等生理状态调节，表明互稳态的设定点可能受多种生理信号调控。这一机制可能保护细胞免受IDR蛋白毒性积累的影响，特别是在神经退行性疾病等蛋白聚集疾病中。

研究揭示了核斑点的新功能——作为集体剂量传感器，通过管理最易凝聚的核蛋白，保护斑点免于达到过度凝聚状态。理解凝聚态蛋白质的稳态调控机制，为开发针对异常蛋白凝聚疾病的治疗策略提供了新视角。