霍利迪连接体与ZMM蛋白的反馈调控机制确保减数分裂交叉保障

本研究揭示霍利迪连接体（HJs）与ZMM蛋白群（Zip1-4, Msh4-5, Mer3, Spo16）通过双向反馈机制维持联合复合体（SC）稳定性：ZMMs保护双霍利迪连接体（dHJs）免受Sgs1-Top3-Rmi1（STR）复合体解离，而dHJs作为支架维持ZMMs的染色体定位。该机制不仅促进交叉形成，还通过抑制DNA双链断裂（DSBs）的重新生成协调减数分裂进程，最终实现交叉保障（crossover assurance）。

　　

dHJs在粗线期稳定联合复合体

为探究重组中间体是否对染色体联会的维持至关重要，研究团队利用^ndt80Δ突变体结合条件性表达工程化结构选择性内切酶Yen1^ON的实验系统。在联会建立后，通过添加β-雌二醇诱导Yen1^ON表达，发现其能触发联合复合体（SC）的完全解组装，但不破坏染色体的轴-环结构。机制上，HJs介导ZMM蛋白与重组结节持续结合，这些结节在同源染色体对的轴界面形成。ZMM蛋白一方面促进SC聚合，同时保护HJs免受非交叉途径的处理。这种ZMMs（稳定HJs）与HJs（保留ZMM蛋白在未来交叉位点）之间的互馈机制，维持了染色体联直到前I期退出时HJ分解酶被激活。

dHJ–ZMM互作维持SC并保护交叉前体

ZMM蛋白（如Zip3、Msh5和Zip4）持续与染色体关联的需求通过auxin诱导降解系统（AID）得到验证。在粗线期阻滞细胞中，5-Ph-IAA添加触发Zip3^AID、Msh4^AID和Zip4^AID的快速降解，导致染色质关联的Zip1完全丢失，以及Rec8积累模式的紊乱，表明联会缺陷和同源染色体分离。这些结果表明，除了先前描述的促进SC组装的作用外，ZMMs对SC的维持也是持续必需的。减数分裂中，ZMMs已知保护新生的重组中间体免受Sgs1–Top3–Rmi1（STR）复合体的解组装，但它们是否同样抑制STR介导的dHJ溶解尚不清楚。重组物理分析显示，在Zip3^AID或Msh4^AID耗竭后，^HIS4::LEU2重组热点处的所有DNA连接分子迅速丢失。与STR介导的dHJ溶解一致，Zip3^AID或Msh4^AID的耗竭导致非交叉产物的特异性增加，而同时耗竭Zip3^AID或Msh4^AID和Sgs1^AID则稳定并积累了DNA连接分子。这些发现表明，ZMMs不仅对交叉指定的重组中间体的形成是必需的，而且对它们持续免受STR复合体溶解成非交叉也至关重要。

dHJs实现SC的可逆解组装

在芽殖酵母中，配对的染色体轴即使在晚前I期也保留组装SC结构的能力。为了测试dHJs是否通过稳定联会起始位点来实现SC聚合的持续重新起始和SC结构的维持，研究团队开发了一种分子工具，可在不丢失dHJs的情况下可逆地解组装SC。该工具利用Smt3作为可逆的翻译后蛋白修饰剂，在SC组装和dHJ处理中起关键作用。条件性蛋白去SUMO化足以在粗线期阻滞细胞中解组装SC，而不会改变^HIS4::LEU2处的DNA连接分子水平，并且同源轴的对齐大体得以维持。在第二步中，Ulp1^ΔN-FRB的核耗竭使得蛋白SUMO化和Zip1沿染色体的重新组装在30分钟内恢复，并在1小时内完全恢复SC结构。为了实验测试dHJs是否为SC重新组装所必需，Yen1^ON与Ulp1^ΔN-FRB同时表达。在这些条件下，大多数细胞核未能重新建立完整的Zip1联会，即使在Ulp1^ΔN-FRB核耗竭4小时后。这些数据支持一个模型，即dHJs在缺乏SC中央区的情况下足以维持同源染色体间的连接。这些连接使得染色体联能够完全重新建立，推测是通过提供一个平台，将ZMM蛋白定位在同源对的轴界面。

dHJ–ZMM反馈抑制DSB形成

在芽殖酵母和小鼠等DSB形成对染色体联会必需的生物中，SC组装被认为抑制了已经成功参与交叉修复的染色体上新的DSBs的形成。这种反馈控制涉及HORMAD蛋白从染色体轴的 displacement，导致DSB能力状态的丢失。因此，研究团队假设通过dHJs和ZMMs的功能互作维持SC可能对持续下调DSB形成至关重要。确实，在粗线期阻滞培养物中表达Yen1^ON导致Hop1（也称为HORMAD）在已丢失Zip1的减数分裂染色体上重新积累。这伴随着Hop1在Thr318处被DNA损伤应答激酶Mec1（ATR）和Tel1（ATM）磷酸化的增加，这是减数分裂DSB形成后发生的。通过Southern blotting直接在两个重组热点（^CCT6和^ERG1）监测DSBs，证实了这些发现，Yen1^ON诱导后DSB水平增加了约3-4倍。这些发现表明，dHJs和ZMM蛋白通过贡献于染色体联会的维持，在维持DSB形成的抑制状态中起关键作用。

dHJ分解促进SC解组装

在前I期退出时，SC解组装与通过Ndt80介导的polo激酶Cdc5（也称为PLK）表达进行的HJ分解在时间上协调。然而，HJ处理是否贡献于SC解组装尚不清楚。为了测试这种可能性，研究团队分析了缺乏所有四种HJ分解酶的减数分裂细胞：^mlh3Δ ^{mms4mn slx1}Δ ^yen1Δ，以下简称四重分解酶突变体。首先，他们证实了异位表达Cdc5足以诱导粗线期阻滞的^ndt80Δ细胞中Zip1从染色体上的丢失，如先前报道。值得注意的是，四重分解酶突变体在长时间内保留了染色体关联的Zip1，尽管Zip1蛋白水平如对照细胞中一样显著降低。活细胞成像Zip1^GFP证实了Cdc5表达后四重分解酶突变体细胞中染色体联会的延迟丢失。由于四重分解酶突变体中的DNA连接分子可能被STR途径替代处理，研究团队将^SGS1的减数分裂无效等位基因（^sgs1mn）与四重分解酶突变体结合。在这个五重突变体中，DNA连接分子未被处理并积累到高水平，SC解组装相比对照和四重分解酶突变体进一步延迟，但仍在实验时间框架内在大约50%的细胞中完成。接下来，研究团队检查了HJ处理是否贡献于^NDT80细胞中前I期到中期I转换时的SC解组装。值得注意的是，SC解组装相对于纺锤体极体（SPB）分离在四重和五重突变体中均延迟。然而，Zip1^GFP信号最终在几乎所有分析的细胞核中丢失。通过分析染色体铺片上的Zip1信号相对于SPB分离，证实了SC解组装延迟。在中期I开始时，大约57%的四重分解酶突变体保留Zip1 stretches，而对照约为28%。这种效应在五重突变体中更为显著（约79%），大约55%的细胞在SPB完全分离的细胞核中仍显示Zip1 stretches。总之，这些发现表明Cdc5通过两种 distinct 机制促进SC解组装。一种与HJ的处理有关，它破坏了SC的维持；另一种可能涉及Cdc5介导的SC组分的磷酸化导致其降解，如先前所提示。

讨论

本研究支持一个模型，其中重组中间体与ZMM蛋白之间的互馈在整个延长的减数分裂前I期稳定了基于DNA和基于蛋白的同源染色体间连接。机制上，ZMM蛋白保护一部分重组中间体免受STR介导的溶解成非交叉。反之，这些长效的重组中间体作为ZMM蛋白与染色质持续结合的 platform。重要的是，通过稳定并将ZMMs精确放置在重组同源对的轴界面，重组中间体在染色体联会的建立和维持中起关键作用，研究团队推测这一过程涉及SC的持续聚合。本研究还表明，dHJ–ZMM介导的SC维持有助于稳定抑制重组染色体上的DSB形成。与这一观点一致，粗线期重组中间体的过早处理触发SC解组装、从头DSB形成和DNA损伤信号传导，最终破坏进入第一次减数分裂。

更广泛地，研究团队提出dHJs与ZMM蛋白之间的互作构成了一个调控电路，协调前I期退出与交叉保障。在这个模型中，dHJ依赖的染色体联会维持提供了一个直接的机制，将减数分裂细胞周期进程与交叉前体的积累耦合。只有当dHJs成功积累时，SC才会稳定地以染色体自主的方式抑制从头DSB形成。这种抑制进而对于抑制全基因组的DNA损伤应答是必需的，否则只要DSBs或其修复中间体存在，就会延迟减数分裂进程。dHJs拥有一个对该模型核心的独特属性：与通常包含广泛单链DNA区域的DSBs和早期DSB修复中间体不同，含有dHJs的晚期重组中间体不太可能激活DNA损伤应答。这一观点得到研究的支持，表明HJ分解酶突变体在前I期退出时存在高水平的dHJs，并经历灾难性的染色体分离。因此，一旦ZMM稳定的dHJs在所有染色体上积累并且联会永久下调DSB形成，细胞就可以进行第一次减数分裂，确保没有未修复的断裂和每个同源对至少有一个交叉前体。交叉结果通过特定ZMMs，特别是MutSγ的dHJ关联进一步 enforced，认为其介导MutLγ（Mlh1–Mlh3）的定向特异性加载和激活，以交叉特异性方式分解dHJs。

最后，研究团队的发现表明重组中间体的分解是SC解组装过程的一部分。尽管需要进一步的工作来剖析导致SC解组装的事件，研究团队设想这一染色体组织 substantial 变化的触发涉及至少两个由polo激酶Cdc5驱动的 distinct 过程：（1）dHJ分解， destabilizes ZMM关联，如此消除了联会（重新）起始位点；（2）磷酸化依赖的SC组分降解，可能更广泛地 destabilizes SC。