基于多组学整合分析探究水飞蓟宾通过非编码RNA调控TGF-β2诱导的人眼小梁细胞纤维化机制

本研究针对青光眼患者房水中TGF-β2水平升高导致小梁细胞纤维化这一关键病理机制，通过RNA测序技术系统分析了mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA的表达谱。研究发现水飞蓟宾能显著逆转TGF-β2诱导的ECM相关基因（COL1A1、α-SMA等）表达异常，并通过构建ceRNA网络揭示非编码RNA在调控细胞迁移、粘附和炎症反应中的重要作用，为青光眼治疗提供了新的药物靶点和理论依据。

　　

青光眼作为全球不可逆性致盲的首要原因，其病理机制与眼压升高密切相关。而眼压的调控关键在于房水流出通道的功能状态，其中小梁网组织扮演着排水枢纽的角色。近年来研究发现，原发性开角型青光眼（POAG）患者房水中转化生长因子-β2（TGF-β2）水平显著升高，这种细胞因子能够诱导人眼小梁细胞（HTM）发生纤维化改变，导致细胞外基质（ECM）异常沉积，从而增加房水流出阻力。然而，TGF-β2调控这一过程的分子机制，特别是非编码RNA（包括长链非编码RNA、环状RNA和微小RNA）在其中扮演的角色，仍有待深入探索。

与此同时，从奶蓟草种子中提取的天然多酚类黄酮化合物水飞蓟宾（silibinin）在多种器官纤维化模型中显示出显著抗纤维化活性。前期研究表明，水飞蓟宾能够抑制TGF-β2处理的HTM细胞中纤维连接蛋白、COL1A1和α-SMA的表达，但其作用机制是否涉及非编码RNA的调控尚不清楚。

为解答这些问题，研究人员在《BMC Genomics》上发表了这项开创性研究，通过整合转录组学分析，系统揭示了TGF-β2和水飞蓟宾对HTM细胞中编码RNA和非编码RNA表达谱的影响，并构建了竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络。

研究采用来自3位无眼病史角膜捐献者的原代HTM细胞，分别设置DMSO对照组、TGF-β2(5 ng/ml)处理组和TGF-β2加水飞蓟宾(50μM)处理组。通过RNA测序技术（RNA-seq）全面分析mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA的表达变化，使用DESeq2等工具进行差异表达分析，并通过miranda软件预测RNA间相互作用关系，利用GO和KEGG数据库进行通路富集分析，最后通过qRT-PCR对关键结果进行验证。

TGF-β2显著改变HTM细胞的转录组特征

研究发现TGF-β2处理使1119个mRNA、319个lncRNA、383个circRNA和30个miRNA表达上调，同时使1165个mRNA、212个lncRNA、449个circRNA和15个miRNA表达下调。这些差异表达基因显著富集于细胞迁移、细胞粘附、ECM组成、TGF-β信号通路等与纤维化过程密切相关的通路。特别值得注意的是，包括COL1A1和ACTA2（α-SMA）在内的经典纤维化标志物均被TGF-β2显著上调。

非编码RNA参与TGF-β2诱导的纤维化过程

研究发现TGF-β2调控的lncRNA与其共表达基因显著富集于细胞粘附、ECM、整合素结合等生物学过程。通过starbase数据库预测发现这些lncRNA可能与DDX54、ELAVL1、FUS等多种RNA结合蛋白（RBP）相互作用，同时可能与TFAP2A、SP1、FOXL1等转录因子（TF）结合。circRNA的宿主基因则富集于缺氧反应、自噬体组装等通路。miRNA分析发现hsa-miR-135a-3p、hsa-miR-145-3p等30个miRNA被TGF-β2上调，而hsa-miR-335-3p、hsa-miR-204-5p等15个miRNA被下调，这些miRNA的靶基因参与微管聚合调控、ECM结构组成等过程。

水飞蓟宾逆转TGF-β2诱导的转录组改变

研究发现水飞蓟宾处理能够逆转TGF-β2引起的大部分转录组变化。在TGF-β2上调的1119个mRNA中，水飞蓟宾使545个表达下调，包括COL1A1、COL4A1、COL5A1等胶原蛋白编码基因以及ACTA2（α-SMA）等肌成纤维细胞标志物。这些被拯救的基因显著富集于细胞迁移、粘附、ECM等通路。在TGF-β2下调的1165个mRNA中，水飞蓟宾使395个表达上调，包括CXCL2、CXCL3、IL1B等炎症因子，这些基因富集于细胞因子介导的信号通路和炎症反应。

水飞蓟宾调控非编码RNA表达

研究发现水飞蓟宾使TGF-β2上调的319个lncRNA中的183个表达下调，使TGF-β2下调的212个lncRNA中的54个表达上调。这些被拯救的lncRNA的共表达基因富集于PI3K信号调控、SMAD蛋白信号转导、ECM等通路。对于circRNA，水飞蓟宾使TGF-β2上调的383个circRNA中的265个表达下调，使TGF-β2下调的449个circRNA中的104个表达上调。对于miRNA，水飞蓟宾使TGF-β2上调的30个miRNA中的22个表达下调，使TGF-β2下调的15个miRNA中的7个表达上调。

ceRNA网络构建揭示调控机制

研究通过miranda软件预测了lncRNA-miRNA和circRNA-miRNA之间的相互作用关系，共鉴定出86,059对lncRNA-miRNA相互作用和30,859对circRNA-miRNA相互作用。在此基础上，构建了lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络，发现ADAMTS10、COL26A1、IGFBPL1和ANXA8L1等ECM相关基因可能受到多个非编码RNA的调控。例如，COL26A1可能被hsa-miR-331-3p靶向，而该miRNA同时可被TSPAN18 mRNA、多个lncRNA（NR_037709.1、XR_936962.1等）和circRNA（circRNA_01764、circRNA_12743等）竞争性结合。

实验验证确认测序结果可靠性

通过qRT-PCR对5个mRNA（ADAM19、LTBP1、GPC4、COL1A1、ACTA2）、5个lncRNA（ENST00000689376、ENST00000686037等）、3个circRNA（circRNA_06605、circRNA_14224、circRNA_12552）和2个miRNA（hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-2-3p）的表达进行验证，结果与RNA测序数据基本一致，证实了测序结果的可靠性。

本研究首次全面描绘了TGF-β2处理下HTM细胞中mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA的表达谱变化，并揭示了水飞蓟宾对这些变化的逆转作用。研究发现水飞蓟宾通过调控非编码RNA的表达，影响ECM相关基因的表达，从而抑制TGF-β2诱导的纤维化过程。构建的ceRNA网络为理解非编码RNA在青光眼小梁网纤维化中的作用提供了新视角，也为水飞蓟宾作为潜在抗青光眼药物的开发提供了理论依据。这项研究不仅深化了对TGF-β2诱导HTM细胞纤维化机制的理解，也为基于非编码RNA的治疗策略提供了新的思路。