从基因组比对到IMGT注释：牛T细胞受体TRG位点新基因发现与功能验证

本研究针对牛T细胞受体TRG位点注释不全的问题，通过LAST比对工具和比较基因组学分析，在牛基因组中鉴定出1个新型TRGV、11个新型TRGJ和1个新型TRGC基因，并利用高通量测序验证新基因表达。该研究完善了牛TRG位点注释，为解析牛γδ T细胞高比例现象提供了关键基因组学基础，对理解反刍动物独特免疫生物学具有重要意义。

　　

在适应性免疫系统中，T细胞受体（T Cell Receptor, TR）扮演着关键角色，其中γδ T细胞在反刍动物中展现出独特的生物学特性。与人类和小鼠中γδ T细胞仅占T细胞总数的1-5%不同，反刍动物（如牛、羊）外周血单核细胞中γδ T细胞比例高达30-60%。这种显著差异暗示γδ T细胞在反刍动物免疫系统中具有特殊功能，但其分子基础尚未完全阐明。牛T细胞受体γ链（TRG）位点的注释不完整限制了人们对牛γδ T细胞多样性和功能的理解。随着染色体级别高质量基因组序列的发布，全面注释TR位点成为可能。

本研究由Zhou等人在《BMC Genomics》发表，通过整合多种基因组组装和比较基因组学方法，对牛TRG位点进行了系统性重新注释。研究人员采用LAST比对工具，通过多参数优化和跨物种序列比对（包括人、小鼠、猫和猕猴等参考物种），结合IMGT（国际免疫遗传学信息系统）标准，对牛基因组中的TRG基因进行鉴定。

关键技术方法包括：使用LAST进行局部序列比对并优化参数（e值设定为15-30），从NCBI（美国国家生物技术信息中心）、NGDC（国家基因组数据中心）和IMGT数据库获取三个牛基因组组装版本（ARS-UCD2.0、NCBA_BosT1.0和IMGT参考序列）；通过MiXCR软件分析牛外周血单核细胞（PBMC）的TRG受体库；采用RSSite在线工具计算重组信息含量（RIC）分数评估重组信号序列与表达相关性；使用Geneious Prime进行TRGC基因比对验证。

结果

Effect of parameters and reference on alignment

通过优化LAST比对参数发现，TRGV基因在e=30参数下平均获得20.5±1.0个匹配，其中18个为已知基因，经手动验证发现1个新型TRGV基因。TRGJ基因在e=15参数下获得最多新型基因（11个）。跨物种参考组合分析表明"人-猴"、"人-小鼠"或"猴-小鼠"组合在降低假阳性率的同时保持高效基因检测能力。

Identification and naming of novel TRGV/TRGJ/TRGC genes

鉴定出1个新型TRGV基因（命名为TRGV11），虽为假基因（含终止密码子且缺失V-RS），但保留V区4个保守氨基酸（C23、W41、疏水氨基酸89和C104）和结构元件（WY motif、CALW序列）。系统发育分析显示TRGV11属于哺乳动物TRGV2亚组，与人类TRGV9有79%相似性，填补了牛TRGV亚组空白。发现11个新型TRGJ基因，其中TRGJ5-3、TRGJ7-1和TRGJ2-4包含完整J-RS（12-RS）、FGXG motif和剪接位点，被预测为功能基因；其余因缺失J-RS或含终止密码子被归类为假基因。此外发现1个新型TRGC基因（TRGC8），与TRGC3第一外显子有97.9%序列一致性，无缺陷特征，可能为功能基因。

Comparison of three bovine TRG loci

比较三个基因组组装（NCBA_BosT1.0、ARS-UCD2.0和IMGT）发现牛TRG位点存在结构变异。NCBA_BosT1.0组装中TRG1位点包含额外TRGV9-3基因和TRGC8簇；ARS-UCD2.0中TRGV6-1因78碱基插入成为假基因，而其他组装中为功能基因；IMGT scaffold（NW_937068）因长度不足缺失部分新基因。这些差异反映了牛TRG位点在个体或品种间的多态性。

The TRG repertoire of bovine PBMCs

通过MiXCR分析三个牛PBMC样本的TRG受体库，获得150,698、82,910和90,812个克隆型，功能序列占比54.82%-56.98%。克隆型分布以低丰度（<0.01%）为主（约70%），CDR3长度呈高斯分布，峰值在12-14氨基酸（最常见长度13占24.00±0.35%）。TRGV和TRGJ基因使用偏好明显：TRGV5-2、TRGV6-2和TRGV1-1表达最高（合计72.11%）；TRGJ4-2和TRGJ6-1占主导（合计50.62%）。新基因TRGJ5-3表达显著（8.68±1.65%），主要与同一簇内TRGV3-1、TRGV7-1和TRGV3-2配对；TRGJ2-4和TRGJ7-1表达极少。J-RS质量与TRGJ表达水平呈中度相关（R2=0.3387, p=0.04712），而V-RS与TRGV表达无显著相关（R2=0.0098, p=0.7060）。

讨论

本研究通过优化比对策略成功鉴定出牛TRG位点中13个新基因，揭示了牛TRG位点在不同基因组组装中的结构变异，并通过表达数据验证了新基因的功能性。TRGJ5-3的高表达表明其在牛γδ T细胞免疫中可能发挥重要作用，而J-RS序列质量与表达的相关性为理解TR基因表达调控提供了新视角。牛TRG位点的特殊结构（两个独立位点TRG1和TRG2，分别位于4q3.1和4q1.5-2.2，相距约32 Mb）可能源于反刍动物祖先的染色体重排事件，与TR基因的显著扩张相关。这些发现不仅完善了牛TRG位点注释，为研究反刍动物γδ T细胞提供了重要基因组资源，也为理解哺乳动物TR基因进化提供了新见解。未来研究可通过机器学习优化参数自动选择，将该方法扩展到更多物种的IG和TR基因鉴定中。