综述：阿尔茨海默病中tau蛋白传播的动物模型

《Neuroscience Research》：Animal models of tau propagation in Alzheimer's disease.

本综述系统总结了tau蛋白在阿尔茨海默病（AD）中朊病毒样传播机制的研究进展。重点评述了表达3R/4R tau异构体的新型动物模型构建策略，强调了种子结构特异性对病理传播的关键影响，为靶向tau蛋白的疾病修饰疗法开发提供了重要理论依据。

　　

1. 引言

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是β-淀粉样蛋白（Aβ）作为老年斑沉积，tau蛋白作为神经原纤维缠结积累。然而，由于缺乏能够精确复制其病理学的动物模型，AD疾病进展的机制仍然未知，这导致针对AD的疾病修饰药物尚未完全建立。

1991年Braak等人对AD患者尸检脑组织进行的广泛病理分析表明，临床症状可以根据tau病理的分布进行分期。虽然Thal等人也确定了Aβ沉积的区域性进展模式，但Aβ分期与临床分期或神经退行性变无关。这些发现表明，病理性tau的传播是AD疾病进展的关键。

2. Tau蛋白

Tau是一种微管相关蛋白，由位于17号染色体长臂上的微管相关蛋白tau（MAPT）基因编码，主要定位于神经细胞的轴突中。在成人脑中，通过选择性剪接从单个MAPT基因表达出六种tau异构体。这些异构体根据是否存在0、1或2个N末端插入片段以及C末端区域中三个或四个微管结合重复序列而有所不同。基于微管结合重复序列的数量，这些六种异构体被分类为3重复（3R）tau或4重复（4R）tau，3R tau和4R tau的表达比例约为1:1。

1998年，在家族性额颳叶痴呆伴帕金森综合征17号染色体相关（FTDP-17）中发现了MAPT基因突变，表明tau异常可导致神经退行性变。以tau蛋白细胞内积累为特征的神经退行性疾病被统称为tau蛋白病，包括AD和其他几种疾病。部分tau蛋白病表现出异构体特异性积累：Pick病（PiD）中为3R异构体；银屑病样颗粒病、皮质基底节变性（CBD）、球状胶质细胞tau蛋白病和进行性核上性麻痹（PSP）中为4R异构体；AD和慢性创伤性脑病中为3R+4R异构体。这表明tau蛋白的细胞内积累在tau蛋白病的发病机制中起核心作用，并对神经退行性变和痴呆的发展有重要贡献。

2.1. AD脑内积累tau的结构

可溶性tau是天然未折叠的，而AD脑内积累的tau则形成具有β-折叠结构的淀粉样纤维。在AD脑的不溶性部分中观察到两种类型的tau纤维：通过电子显微镜（EM）观察，配对螺旋纤维（PHFs）直径为10–20 nm，以及直纤维（SFs）直径为15 nm。2017年，通过冷冻电镜分析揭示了tau纤维的详细分子结构。PHFs和SFs的核心区域由73个氨基酸组成，从缬氨酸306到苯丙氨酸378，形成C形原纤维。两个原纤维背对背排列并堆叠形成纤维结构。这两个原纤维在PHFs中对称排列，但在SFs中不对称排列，导致形态差异（即螺旋状或线性）。由于原纤维由微管结合区的重复结构域3和4（R3和R4）组成，因此3R和4R tau异构体都可以并入tau纤维。这解释了为什么所有六种tau异构体都在AD中积累。此外，该区域的氨基酸序列在人类、小鼠和狨猴中完全保守，这对于开发AD样tau传播的动物模型具有重要意义。

冷冻电镜分析的最新进展表明，tau原纤维的结构因疾病而异。这表明纤维结构定义了每种疾病，并且对于理解其致病机制至关重要。此外，AD脑中的不溶性tau纤维经历广泛的翻译后修饰（PTMs），例如过度磷酸化、泛素化、乙酰化和脱酰胺化。同样，这些PTMs因疾病而异，反映了tau纤维核心结构的差异。

2.2. 病理性tau的朊病毒样传播

对AD死后脑组织的神经病理学研究使得基于tau病理空间分布的疾病分期成为可能，这被称为Braak分期。最初，tau病理出现在经嗅皮质的前α层（I-II期），然后以固定模式扩散到边缘系统，包括海马CA1（III-IV期），最后扩散到整个皮质（V-VI期）。这种分期也通过tau正电子发射断层扫描（PET）在活体个体中得到证实。因此，有人假设tau病理像朊病毒一样在细胞间传播。朊病毒是由错误折叠蛋白质组成的传染性因子，通过作为模板将其异常构象传递给正常蛋白质。例如，在某些朊病毒疾病中，具有交叉β-折叠结构的异常朊病毒与正常月病毒蛋白相互作用，将其转化为异常形式，然后进行扩增和传播。类似的概念适用于tau；在AD中积累的tau纤维也表现出交叉β-折叠结构。越来越多的证据支持这一假设。例如，tau纤维在体外和培养细胞中证明了可溶性tau的种子依赖性聚集。

3. Tau传播的动物模型

2009年，Clavaguera等人从具有P301S突变的转基因（Tg）小鼠中获取含有病理性tau的脑提取物，并将其脑内注射到表达野生型人tau的转基因小鼠中。结果，在被注射的小鼠中形成了tau病理，并最终扩散到遥远的脑区。这是首个在体内实验证明tau传播是由外源性tau聚集体引起的研究，代表了AD研究领域的革命性进展。此后，这种脑内注射技术（类似于朊病毒感染实验中使用的技术）被广泛用于诱导tau传播。使用这种策略，已经开发了几种使用不同品系和物种的AD动物模型。值得注意的是，在生成AD模型动物时，tau异构体的表达因物种而异。特别是，在成年人类和与人类密切相关的非人灵长类动物（如恒河猴、大猩猩、长臂猿和黑猩猩）中表达六种异构体（3R和4R）。另一方面，成年啮齿类动物和常用作实验动物的普通狨猴主要表达4R异构体。缺乏3R tau表达一直是开发精确阿尔茨海默病（AD）模型的重大障碍。

3.1. Tau传播的小鼠模型

许多研究通过脑内注射在小鼠中研究了tau传播。使用了各种注射材料，包括合成的tau纤维和来自AD人脑的tau。合成tau纤维可以通过将重组tau与肝素孵育轻松制备。这些肝素诱导的tau纤维被广泛用于AD研究。然而，将肝素诱导的tau纤维脑内注射到非转基因小鼠中并未诱导tau病理形成，表明它们在体内缺乏种子效力。这是由于肝素诱导的纤维与AD脑中形成的tau纤维之间存在结构差异。相比之下，我们已经证明在硫酸葡聚糖（DS-tau）存在下制备的tau原纤维在结构上不同于肝素诱导的tau纤维。将DS-tau脑内注射到非转基因小鼠中导致了磷酸化tau病理的形成。tau病理从注射部位传播到其他解剖学上相连的区域。与AD中的tau病理相似，DS-tau注射小鼠中积累的tau对泛素、p62和Gallyas银染呈阳性。积累的tau由内源性小鼠tau组成，并且在将DS-tau注射到tau敲除小鼠后未观察到tau病理。这清楚地表明DS-tau在没有过表达或突变的情况下引起朊病毒样传播。尽管我们的模型简单且高度可重复，但它不能准确复制AD中的tau病理，因为它只能诱导4R tau积累。这些研究表明，原始种子的结构在tau传播中起重要作用。

一些研究使用了来自AD脑的tau。例如，将来自AD脑的纯化PHF-tau注射到非转基因小鼠中导致由内源性小鼠4R tau组成的磷酸化tau病理的形成和传播。相比之下，注射来自对照人脑的提取物或经tau免疫去除的AD提取物并未诱导tau病理形成。这些研究在注射AD来源的样本后，关于tau病理的形成和传播方面分享了相似的结果。与成年小鼠相比，老年非转基因小鼠的tau传播增强。然而，在这些实验中，关于神经元细胞丢失尚未达成共识。这种差异可能归因于所使用的AD病例中积累的tau的不同特征。

3.2. 表达3R和4R tau异构体的小鼠模型

由于成年啮齿动物脑中仅表达4R tau，因此在非转基因小鼠中不可能模拟AD样tau异构体组成。为了克服这一限制，开发了几种表达3R和4R tau的小鼠品系。Umeda及其同事将内含子10的序列插入到编码最长人tau异构体的cDNA中，并在钙/钙调蛋白依赖性激酶2启动子下培育了转基因小鼠。内含子10已被证明影响外显子10的剪接，3R tau或4R tau的表达分别取决于外显子10的包含或排除。因此，该转基因能够实现人源外显子10的生理性剪接。该转基因小鼠系（Tau264）表达野生型人tau的3R和4R异构体以及内源性小鼠tau。Gumucio等人培育了tau外显子10敲除小鼠。一个等位基因缺失外显子10（E10^+/-）的小鼠以1:1的比例表达3R和4R tau。He等人培育了过表达六种人tau异构体并敲除内源性鼠tau的转基因小鼠（6hTau小鼠）。该模型的tau蛋白水平近乎是非转基因小鼠内源性tau的两倍，约是人脑的三倍。将来自包含AD、PiD、CBD和PSP的人tau蛋白病脑的tau种子脑内注射到h6Tau小鼠中，诱导了与注射的人tau种子具有相同异构体组成的tau病理。

由于据报道过表达会导致tau的错误定位，这与正常生理状态不同，因此最近更倾向于使用具有内源性tau水平的 knock-in (KI) 小鼠。Hashimoto等人通过同源重组将小鼠Mapt基因人源化，培育了表达六种人异构体的KI小鼠（MAPT-KI小鼠）。该模型的tau表达水平与内源性tau相似，尽管在mRNA水平上3R tau表达略高。此外，他们通过将MAPT-KI小鼠与App-KI小鼠（App^NL-G-F KI）杂交培育了双KI小鼠，以重现Aβ和tau病理。将人源AD种子脑内注射到双KI小鼠中，导致tau病理的传播比在MAPT-KI小鼠中更广泛。然而，另一项研究表明，在注射了AD来源tau种子的双KI小鼠（与App^NL-F KI杂交）中，Aβ的存在并未增加tau包涵体负荷。Aβ对tau传播的这种不一致影响可能是由于积累的Aβ结构或所使用的AD来源tau种子的特性所致。

我们还通过使用基因组编辑技术跳过小鼠Mapt基因的外显子10，培育了表达六种tau异构体的小鼠。纯合小鼠仅表达3R tau，而杂合小鼠表达3R和4R tau（Tau3R/4R小鼠）。Tau3R/4R小鼠表达所有六种鼠tau异构体，因此，当注射来自人脑的tau种子时，可以区分外源人tau和内源鼠tau。将来自AD、CBD和PiD脑的不溶性部分注射到Tau3R/4R小鼠中，揭示了过度磷酸化tau病理的形成，其异构体组成与患者脑中的相同。这些体内实验证明了疾病特异性tau异构体传播在tau蛋白病发病机制中的重要性。因此，在AD研究中应使用能够准确重现相同异构体组成的模型。

3.3. Tau传播的非人灵长类动物模型

啮齿类模型更容易维护，需要更少的笼舍空间，并且寿命更短。然而，它们的大脑结构与人类显著不同。这推动了使用非人灵长类动物开发AD模型，它们的大脑结构与人类更相似。

使用了鼠狐猴，这是一种小型灵长类动物，体重60–120克，寿命约12年。据报道，它们的大脑衰老特征与人类相似，一些鼠狐猴表现出与脑萎缩相关的年龄相关认知改变。作者将AD脑匀浆脑内注射到中年狐猴中，发现注射AD脑匀浆的组表现出进行性认知障碍、神经元活动改变和脑萎缩。在所有动物（6只中的6只）中都观察到了Aβ沉积，但只有6只中的2只在注射后18个月（mpi）时在注射部位附近的脑区表现出tau病理。这表明在鼠狐猴中观察到的神经元功能障碍可能不是由病理性tau引起的。Darricau等人比较了注射了AD来源tau种子的恒河猴，在有和没有注射合成寡聚Aβ的情况下的tau病理。注射AD来源tau种子的动物即使在18 mpi时也表现出稀疏的磷酸化tau病理。相比之下，注射了AD来源tau种子和寡聚Aβ的动物显示出tau病理的形成和传播增加，以及突触丢失和神经胶质增生。然而，这些研究中并未分析tau病理的异构体组成。

4. 结论

过去十年中，tau传播动物模型的开发取得了快速进展，产生了与AD中tau传播非常相似的模型。鉴于种子结构在AD建模中的重要性，最佳方法是将AD来源的tau种子脑内注射到表达所有六种tau异构体的小鼠中。这些表达六种异构体的小鼠，当与APP-KI小鼠杂交时，可以更接近地复制AD病理。相比之下，使用来自人脑的样本进行的实验存在可重复性问题，并且与获取和使用死后组织相关的限制和伦理问题使得这些方法不适合大规模筛选。报告之间的结果存在一些差异，这可能归因于不同病例间病理性tau的质量和数量（即PTMs或不溶性tau的数量）的变异，以及其他不溶性成分（如Aβ，它可以促进tau积累）的污染。值得注意的是，使用AD来源tau的研究使用了不同的制备方法，例如脑提取物、寡聚tau部分和sarkosyl不溶性部分。由于来自AD脑的tau的种子能力在不同部分之间存在差异，这些实验可能导致可重复性差。其他研究根据tau的数量或体外种子能力选择用于注射实验的AD病例。因此，成功的建模可能需要选择合适的AD病例并密切监控制备方法。AD来源tau的标准化（例如通过使用体外种子能力等）将有助于更好地比较研究。这可以通过使用具有AD型结构的合成tau纤维来实现。最近有报道称，AD折叠tau可以从由氨基酸297–391组成的重组tau片段产生。这表明可以在不使用来自人脑的样本的情况下复制AD样tau传播。这一策略可能对未来AD研究做出重大贡献，并且对于疾病修饰药物的大规模筛选特别有用。