中国东北地区腹泻犊牛中牛细小病毒1型的分离鉴定及其进化与生物学特性研究

本文首次系统分离并鉴定了中国东北地区腹泻犊牛中的14株牛细小病毒1型（BPV1），揭示了其遗传进化特征及抗原变异规律。研究通过全基因组测序和系统发育分析证实了BPV1的高流行性（与参考株同源性达96.5%-99%），首次报道了区域毒株间的重组事件（涉及JL108等4株），并发现VP2蛋白抗原表位突变（A362T/N399D）未引起显著构象变化。此外，病毒对氯仿敏感性的发现与既往研究不符，为BPV1的分子演化机制及疾病防控提供了新见解。

　　

引言

牛细小病毒1型（BPV1）属于细小病毒科（Parvoviridae）博卡病毒属（Bocaparvovirus），是一种无囊膜的单链DNA病毒，其基因组长度约5–6 kb，包含三个开放阅读框（ORF）：ORF1编码非结构蛋白NS-1/NS-2（NS-1具有C端转录激活结构域），ORF2编码NP蛋白，ORF3编码结构蛋白VP1/VP2。其中VP2（位于VP1的137–674位氨基酸）介导病毒受体结合、抗原性及致病性，其晶体结构揭示了关键受体结合位点。BPV通过消化道、呼吸道及垂直传播（胎盘感染）途径扩散，感染早期常无症状，但妊娠母牛可能引发流产或死胎，犊牛感染后主要表现为腹泻，部分病例可发展为严重消化系统功能障碍。目前已知的牛细小病毒包括6个亚型，其中BPV1、BPV2和BPV3具有重要临床意义。BPV1自1961年首次从腹泻犊牛中分离以来，已在澳大利亚、欧洲、日本等地广泛检出，血清学调查显示其抗体阳性率较高（美国86%、英国46%、日本50%）。中国此前关于BPV的研究较少，2016年东北地区首次报道BPV3，2018年黑龙江发现BPV2，2021年四川和2022年广西分别分离到BPV1毒株。本研究首次对中国东北地区BPV1进行了系统流行病学调查，通过病毒分离、全基因组测序及进化分析，揭示了流行毒株的分子特征及演化关系。

材料与方法

样本采集

2017–2022年间从黑龙江、吉林和内蒙古的多个牛场共采集673份犊牛腹泻样本。所有样本经畜主知情同意后收集，并存储于?80°C备用。研究方案经黑龙江省动物科学伦理委员会及东北农业大学实验动物伦理委员会批准（批准号：NEAUEC20200321）。

病毒DNA提取与PCR检测

使用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取粪便样本中的病毒DNA。根据GenBank中BPV参考株（DQ335247、NC001540）设计VP2基因特异性引物（上游：5′-ATGGAGGTATCAAATGATATACCTA-3′，下游：5′-CTACAGGACTTTGTGGTGATTGAAT-3′），通过PCR扩增1600 bp片段，反应条件为94°C预变性3分钟，98°C变性10秒、56°C退火30秒、68°C延伸1分钟，共30个循环，最终68°C延伸5分钟。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

病毒分离与敏感细胞检测

使用BT细胞（牛睾丸细胞）进行病毒分离，细胞培养于含DMEM和胎牛血清（FBS）的培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养。样本经0.22 μm滤膜过滤后接种细胞，观察细胞病变效应（CPE）。当80%细胞出现CPE时，收集细胞裂解上清液并保存于?80°C。为评估病毒增殖的敏感细胞，将分离株接种于原代牛肾细胞、原代牛睾丸细胞、BT细胞、MDBK细胞及传代牛肺细胞，每8小时观察CPE变化，并通过PCR检测连续传代（第1、3、5、7、9、11、13、15代）病毒的稳定性。

病毒纯化与电镜观察

将病毒液10倍系列稀释后接种于无血清牛肺细胞6孔板，37°C吸附3小时，PBS洗涤后加入1.2%低熔点琼脂，凝固后倒置培养。出现CPE后加入中性红琼脂，观察斑块形态并分离单个斑块进行病毒纯化。病毒颗粒经PEG8000浓缩后，通过磷钨酸负染，使用透射电镜（TEM）观察。

间接免疫荧光 assay

BT细胞接种病毒36小时后，用预冷无水乙醇固定，0.2% Triton X-100透化，3% BSA封闭，依次加入小鼠抗BPV VP2单克隆抗体及FITC标记的山羊抗小鼠IgG，荧光显微镜下观察信号。

序列比对与进化分析

病毒基因组通过Klenow+合成双链后克隆至pEASY BLUNT载体并测序。使用Espript 3.0和DNAStar进行氨基酸序列及基因组同源性分析，基于完整CDS区与GenBank中BPV参考株构建系统发育树（MEGA7，邻接法，Kimura二参数模型，1000次bootstrap检验）。使用RDP4和SimPlot进行重组分析，检测潜在亲本株及重组断点。

VP2蛋白生物信息学分析

通过SWISS-MODEL以BPV1经典株HADEN（SMTL ID: 4qc8.1）为模板预测VP2三级结构，PyMol标注突变位点。使用BepiPred-2.0、SVMTriP和IEDB预测B细胞抗原表位，分析突变对抗原性的影响。

病毒理化性质检测

评估病毒对氯仿（10/30分钟）、温度（4°C/25°C/37°C/56°C，3小时）、pH（3/7/9，1小时）、胰酶（0.125%–1%，1小时）及胆汁盐（0.01 g/mL、0.1 g/mL，1小时）的耐受性，通过TCID₅₀（Reed-Muench法）测定病毒滴度变化。

结果

病毒分离与鉴定

从673份样本中成功分离到14株BPV（表S1），其中DQ7498株在BT细胞中CPE出现最快，感染早期细胞变圆、收缩，36小时后脱落坏死。病毒在BT细胞和牛肺细胞中可稳定传代（图1A），PCR验证传代稳定性（图1B–F）。经3轮斑块纯化后（图1G），第15代病毒滴度测定显示DQ7498滴度最高（10^8.12 TCID₅₀/mL，图1H）。电镜观察显示病毒颗粒为无囊膜二十面体结构，直径约25 nm（图2A），间接免疫荧光证实感染细胞中存在特异性绿色信号（图2B）。

系统发育与重组分析

分离株与经典BPV1株（NC001540、DQ335247）及牦牛源BPV1株聚于同一进化支（图3A），同源性达96.5%–99%，而与BPV2（KP264971等）、BPV3（NC_074970.1）及BPV4（PP125177）同源性较低（34.5%–42.5%），确认所有分离株均为BPV1型。RDP4分析发现JL108、JL60、DQ7706和DQ7724株存在重组事件，主要亲本为DQ8186，次要亲本为ZD0510，重组断点位于NS1-VP2区（nt 2503–4585，图3B）。SimPlot进一步验证3200–3800区域重组可能由未分离毒株介导（图3C）。

氨基酸序列与VP2抗原性分析

与参考株（DQ335247、NC001540）及四川牦牛株（MW032437.1）相比，分离株在NS-1区存在9个位点突变（如I25V、E782K等），其中I825V与MW032437.1一致；NP区存在L124V突变（4株）；VP1区存在11个位点突变（如A29S、A499T等），其中5个（A29S、A38E、L51I、I267V、A499T）与MW032437.1相同（图4A–C）。VP2蛋白分为DQ7498型（含DQ7498等5株）和DQ8186独特突变型。三级结构预测显示突变未引起显著构象变化（图5）。抗原表位预测发现所有分离株均存在共同表位突变A362T和N399D，DQ8186额外存在A146R和H446N突变，提示潜在抗原性改变（表3）。

理化性质

所有分离株对氯敏感（10分钟处理即导致滴度显著下降，30分钟完全失活）；56°C以上温度不稳定；对酸、碱条件耐受性差；对胰酶不敏感；对胆汁盐中度敏感（图6）。

讨论

本研究首次系统分离了中国东北地区腹泻犊牛中的14株BPV1，揭示其与经典Abinanti株高度同源（>97.7%），证实BPV1在该地区广泛流行。与既往报道的BPV2、BPV3共存现象提示东北地区可能存在多型别共传播。氨基酸突变分析发现分离株与四川牦牛株共享部分突变（如NS-1的E782K/I825V、VP1的A29S/A499T），可能代表国内流行株的共性特征。重组事件（JL108等4株）的发生可能与东北地区小规模养殖、跨省运输及环境污染等因素有关，需进一步监测重组株的传播与致病性。

NS-1蛋白的C端突变（E782K/I825V）位于转录激活域，可能影响病毒复制与毒力；VP2表位突变（A362T/N399D）虽未改变整体结构，但可能通过影响受体结合或抗体识别改变免疫原性。值得注意的是，病毒对氯仿的敏感性与传统认知（无囊膜病毒通常耐氯仿）不符，推测与衣壳蛋白关键氨基酸突变有关。

本研究为BPV1的分子演化、抗原变异及跨种传播机制提供了重要数据，也为疫苗设计和防控策略制定奠定了理论基础。未来需扩大样本量与时空范围，深入探究重组事件的生物学意义及突变对病毒适应性的影响。

伦理批准

本研究使用样本均为农场日常管理所提供，经黑龙江省动物科学伦理委员会及东北农业大学实验动物伦理委员会批准（批准号：NEAUEC20200321）。

数据可用性

14株BPV1完整CDS序列已保存于GenBank（登录号：PV601132–PV601145）；TCID₅₀数据公开于Mendeley Data（DOI: 10.17632/hx9rxh9y9y）。