酪氨酸激酶Cps2C通过磷酸化糖基转移酶调控猪链球菌2型荚膜多糖合成及致病性的机制研究

本研究发现猪链球菌2型（S. suis 2）荚膜合成基因簇5'端的酪氨酸激酶Cps2C通过直接磷酸化糖基转移酶（Cps2F/Cps2H）调控荚膜多糖（CPS）合成，并影响细胞分裂、糖转运及宿主免疫逃逸。缺失cps2C导致菌体荚膜厚度减少（23 nm vs 9.1 nm）、抗吞噬能力下降（9.72倍）及小鼠模型中毒力显著减弱。磷酸化蛋白质组学揭示Cps2C下游涉及CPS合成（Cps2F/H/J、NeuB）、细胞分裂（FtsZ/DivIVA/SepF）及磷酸转移酶系统（PTS）等多通路调控网络，为靶向荚膜合成的抗感染策略提供新视角。

　　

酪氨酸激酶Cps2C缺失对猪链球菌2型生长及形态的影响

研究通过同源重组构建cps2C缺失突变株（Δcps2C），经PCR、RT-PCR及Western blot验证成功。突变株菌落直径显著减小（2.39 mm vs 1.46 mm），溶血环直径与菌落直径比值升高（1.29 vs 2.00），但溶血活性无显著差异。平板菌落计数显示Δcps2C生长迟缓，表明Cps2C缺失导致细菌增殖受阻。

革兰染色及CFSE荧光染色发现Δcps2C链长度显著缩短，短链比例（1-3个细胞）增加而长链比例下降。扫描电镜显示突变株细胞分裂隔膜形成异常，证实Cps2C参与细胞分裂调控。

荚膜多糖合成能力的显著下降

通过孔雀石绿磷酸盐染色、Hiss染色及荚膜多糖定量分析，发现Δcps2C荚膜结构明显减少，CPS含量降低至14.0 μg/mL（野生型为52.51 μg/mL）。结构光照明显微镜及透射电镜观察显示突变株荚膜厚度显著变薄（23 nm vs 9.1 nm），且菌体形态更细长（长宽比增加），表明Cps2C是荚膜生物合成或组装的关键调控因子。

磷酸化蛋白质组学揭示Cps2C底物网络

Western blot检测发现Δcps2C总蛋白磷酸化水平显著降低。定量磷酸化蛋白质组学分析鉴定到133个蛋白的190个磷酸位点发生显著改变，其中141个位点下调。COG功能分类显示下调磷酸蛋白主要涉及：碳水化合物转运与代谢（PTS系统、ABC转运蛋白）、细胞壁/膜生物合成（Cps2F/H/J、NeuB、GlmM）、细胞周期控制（FtsZ/FtsE/SepF/DivIVA/STK）及翻译核糖体生物合成。GO分析进一步富集于碳水化合物转运、细胞分裂及膜蛋白相关通路。蛋白质互作网络提示Cps2C与荚膜合成相关蛋白（Cps2F/H/J、NeuB）及细胞分裂蛋白存在直接或间接相互作用。

体外激酶实验验证直接底物

纯化重组Cps2C蛋白（45 kDa）并测定其酶活性为128.4 IU/mL。体外激酶实验证实Cps2C可直接磷酸化糖基转移酶Cps2F（酪氨酸位点）和Cps2H（酪氨酸及苏氨酸位点），其中Cps2F第177位酪氨酸为关键磷酸化位点。Motif分析提示Cps2C底物特征序列为KxxxxxYxxxxxx（x为任意氨基酸）。

宿主细胞黏附增强与免疫逃逸能力减弱

CFSE标记细菌与HEp-2细胞共培养发现，Δcps2C黏附能力显著增强（黏附率15.57 vs 4.20）。随时间延长（1-4小时），突变株黏附数量持续增加而野生型无变化。Raw264.7巨噬细胞吞噬实验显示Δcps2C抗吞噬能力下降9.72倍，流式细胞术检测吞噬阳性细胞比例显著升高，表明荚膜缺失暴露细菌表面促吞噬表位。

体内致病性显著减弱

小鼠感染实验显示，Δcps2C感染组存活率显著高于野生型（1×10⁸ CFU腹腔注射）。感染后6小时血清炎症因子（IL-6、IL-8、IL-12、IFNγ、CCL3/5、CXCL9）水平显著降低。全血存活试验及血液菌载量检测表明突变株更易被清除。组织病理学显示Δcps2C感染小鼠肺部和脾脏损伤较轻：肺组织炎性细胞浸润减少、脾脏红白髓界限清晰、出血减轻。表明Cps2C缺失通过削弱荚膜介导的免疫逃逸导致毒力衰减。

讨论：Cps2C的多功能调控网络

本研究揭示Cps2C作为酪氨酸激酶通过磷酸化糖基转移酶（Cps2F/H）直接调控荚膜合成，同时影响细胞分裂（FtsZ/DivIVA/SepF）、肽聚糖合成（GlmM/STK）及糖转运（PTS系统）等多重生物学过程。与肺炎链球菌CpsD同源蛋白功能保守，但Cps2C在S. suis 2中调控网络更为复杂。磷酸化修饰可能通过调节酶活性、底物识别或蛋白互作影响CPS合成效率。未来需聚焦关键磷酸化位点功能验证及STK-Cps2C交叉调控机制探索，为靶向荚膜合成的抗感染治疗提供新策略。