理性设计微生物联合体通过靶向神经代谢物产生调控帕金森病黑腹果蝇模型的神经退行性进程

本研究通过基因组尺度代谢模型（GSMM）理性设计并实验验证了一种合成微生物联合体（含Levilactobacillus brevis、Lacticaseibacillus paracasei和Bacteroides thetaiotaomicron），该联合体在生物反应器中成功产生γ-氨基丁酸（GABA）。在帕金森病（PD）黑腹果蝇模型中，该联合体显著改善雌性果蝇的运动功能障碍，部分恢复PD相关的能量平衡、氨基酸与神经递质代谢紊乱，并提升微生物组多样性和乳酸菌丰度，为神经退行性疾病的微生物组干预策略提供新见解。

　　

引言

肠-脑轴实现了中枢神经系统与肠道之间的双向通信，特定微生物代谢产物能够影响神经退行性进程。人类肠道微生物组包含胃肠道中共生和互利微生物的一组基因组，这些微生物与宿主共存、影响肠道稳态并在健康中发挥重要作用。其组成的变化与多种疾病的发展相关，包括肠道、代谢和免疫疾病。近年来，肠道微生物组对精神疾病和神经退行性变的影响日益显著。这种通信通过迷走神经、下丘脑-垂体-肾上腺轴以及微生物代谢物（如短链脂肪酸（SCFA）和神经递质）等途径实现。

丁酸盐是宿主健康最关键的一种SCFA，能够改善肠道屏障功能、刺激免疫系统并减少炎症，同时对神经系统表现出神经保护作用。此外，某些肠道微生物能够从头合成神经递质，如多巴胺、血清素、去甲肾上腺素和γ-氨基丁酸（GABA）——中枢神经系统的主要抑制性神经递质。这一特性广泛分布于肠道微生物中，尤其是在拟杆菌属（Bacteroides）、乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）中，它们利用这些化合物作为交叉喂养分子或生长因子，并调节诸如酸应激等生理过程。

脑内GABA的减少与焦虑、抑郁和神经退行性变有关。值得注意的是，将产生GABA的细菌物种乳杆菌和双歧杆菌递送到老年大鼠的肠道中，能够调节前额叶皮层和海马的脑代谢谱，对记忆产生有益影响。另一项研究表明，在纤维肌痛患者的肠道微生物组中，产生GABA的细菌（如双歧杆菌和乳杆菌物种）的丰度降低，同时伴随谷氨酸积累和GABA耗竭。参与GABA合成的基因（gadC和gadB）也下调。

临床和临床前证据表明，肠道微生物组成的变化可能会增加神经退行性疾病的风险。帕金森病（PD）患者的粪便代谢组显示，其肠道微生物组的改变与细菌物种产生的代谢物变化相关。具体而言，观察到特定代谢物（包括GABA）分泌的变化。PD与患者肠道微生物组改变之间存在相关性。一项大规模队列研究表明，PD患者中普雷沃菌科（Prevotellaceae）的丰度降低。此外，与健康对照相比，PD患者中产生丁酸盐的细菌（如Roseburia和Faecalibacterium spp.）的丰度显著降低。有趣的是，有证据将PD与胃肠道中α-突触核蛋白的积累联系起来。

尽管有这些发现，微生物代谢物如GABA或SCFA在神经退行性变中的作用仍不清楚，尤其是在主要针对多巴胺能神经元的PD中。虽然微生物GABA生产已在体外得到证实，但其在体内的功能作用，特别是在神经保护方面，仍然是推测性的。本研究旨在评估一种推定的具有神经活性的微生物联合体对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）遗传性PD模型的影响，这是一个研究神经退行性过程的成熟系统。

结果

SteadyCom模拟揭示了产生GABA和丁酸盐的联合体

本研究旨在理解产生神经代谢物的微生物联合体在黑腹果蝇神经退行性模型中的影响。我们首先关注GABA和丁酸盐在神经保护中的作用。我们获得了九种候选肠道微生物的半自动代谢重建，这些微生物因其产生GABA、与来自双歧杆菌属、乳杆菌属或拟杆菌属的GABA生产者相互作用或是丁酸盐产生菌（Butyrate-Producing Bacteria）而被选中。

所有重建都预测了在葡萄糖上的生物量生产，而B. thetaiotaomicron和B. adolescentis能够使用菊粉作为碳源生产生物量，通常在葡萄糖中观察到更高的生长速率。少数模型显示出正的体外GABA通量：Bifidobacterium adolescentis、Bacteroides thetaiotaomicron和Lactiplantibacillus plantarum。虽然Levilactobacillus brevis G2在单一培养模拟中没有表现出GABA生产，但其模型重建包含GABA的合成和输出反应，这与之前的报告一致。

然后我们使用这些模型模拟多物种联合体，评估群落生长、代谢物生产和代谢交叉喂养。我们组装并测试了涉及初级和次级发酵菌以及预测的GABA或丁酸盐生产菌的组合。这些模拟产生了23个预测使用葡萄糖或菊粉生产GABA的联合体。值得注意的是，生长速率与GABA通量呈负相关。增加联合体中的细菌数量并不一定会增加生长速率或GABA产量。一些联合体表现出高GABA和丁酸盐通量。例如，一个由B. adolescentis、Coprococcus eutactus、B. thetaiotaomicron和L. brevis组成的联合体产生了高GABA（联合体9；1.48 mmol gDW^?1h^?1）和丁酸盐通量（4.39 mmol gDW^?1h^?1）。通常，L. brevis和L. plantarum在体外对GABA生产的贡献最大。

通量变异性分析（FVA）后来被用于探索次优代谢状态并确认群落代谢灵活性。在联合体9中，尽管三个成员具有GABA合成能力，但只有两个在最佳生长速率下积极生产神经代谢物。随着群落生长的增加，GABA通量减少，表明群落生物量优化和神经代谢物输出之间存在权衡。联合体9的FVA分析显示，乙酸盐、乳酸盐和谷氨酸的交叉喂养支持了GABA和丁酸盐的生产，形成了一个复杂的相互作用网络。

在一些联合体中，GABA被预测在达到最大群落生长速率之前产生。例如，一个由L. brevis、B. thetaiotaomicron和Lacticaseibacillus paracasei（C8c）组成的联合体在低生长速率下显示出这些物种的相等相对丰度。该联合体在最佳生长速率下没有显示GABA通量，但在次优速率下GABA通量相当显著。如上所述，乙酸盐、乳酸盐和谷氨酸的交叉喂养似乎在某些微生物联合体的体外GABA生产中必不可少。

GABA筛选显示单一培养和共培养中的GABA生产

基于模拟结果，我们筛选了15个单一培养、11个共培养、八个三重培养和两个四重培养的GABA生产能力。在八个上清液中检测到GABA，包括L. brevis G2和B. thetaiotaomicron VPI 5482。值得注意的是，L. brevis G2和L. paracasei M38的共培养在没有补充谷氨酸单钠的情况下产生了GABA。然而，添加谷氨酸单钠增强了GABA条带，表明底物可用性可以在体外增强生产。

联合体批次生物反应器生长和底物消耗

选择了六个在体外生产GABA的微生物联合体用于使用菊粉作为碳源的分批发酵：G2M38、BvulgM38、G2BtM38、G2BovaM38、D3BtM38和BtLsG2M38。生物学重复在生长动力学方面显示出相似的行为。含有四种细菌的联合体更快地进入指数期。在大多数联合体中，菊粉在12小时时被部分消耗，在26小时时几乎耗尽。联合体BtLsG2M38在12小时时显示出更快的消耗，与其较短的滞后期相关。这些动态很可能由L. paracasei M38驱动，其编码菊粉降解酶。

GABA生产在发酵结束时达到峰值。联合体G2BtM38和G2BovaM38在体外表现出更高的GABA产量。六个联合体中的两个合成了GABA（3 g/L）：G2BtM38和BtLsG2M38。在三物种联合体中，L. paracasei M38占主导地位。相比之下，四物种联合体由L. symbiosum WAL 14673和L. paracasei M38主导，后者在整个发酵过程中丰度增加。

关于SCFA生产，联合体BtLsG2M38生产了浓度为1.88 g/L的丁酸盐。该联合体还产生了最高的乙酸盐浓度，甚至与BtG2M38相比也是如此。在含有L. paracasei M38的联合体中观察到高水平的乳酸盐（另一种潜在的神经代谢物），而琥珀酸盐是含有拟杆菌属物种的联合体的特征。基于这些结果，选择了产生高乳酸盐和GABA的联合体G2BtM38，以评估其对黑腹果蝇神经退行性模型的影响。

神经活性联合体对黑腹果蝇运动缺陷、存活和多巴胺能变性的影响

使用黑腹果蝇的遗传性PD模型在体内评估了所选联合体对神经退行性变的影响。该模型基于具有聚集特性（A30P）的α-突触核蛋白的过表达。在此，果蝇表现出PD样表型，包括运动缺陷、多巴胺能神经元损失和过早死亡。并行评估了四组：未经处理的对照组和PD组（C；PD），以及在幼虫阶段接受微生物联合体的对照组和PD组（C+；PD+）。

我们在第10天和第25天测试了雌性果蝇在攀爬 assay 中的运动能力。正如预期，PD果蝇与对照组C相比攀爬能力显著降低，显示出由于α-突触核蛋白过表达导致的攀爬能力下降。相比之下，用联合体处理的PD果蝇（PD+）与未经处理的PD果蝇相比显示出显著改善的攀爬指数，并且在统计上与对照组（C和C+）无法区分。这些结果表明，早期接触微生物联合体减轻了PD果蝇的运动衰退，产生了神经保护作用。

我们后来通过使用抗酪氨酸羟化酶（合成多巴胺所需的酶）的免疫染色评估了雌性果蝇中多巴胺能神经元的总数。在第25天，表达α-Syn的果蝇的TH阳性多巴胺能神经元显著少于对照组（C和C+）。PD+组显示出一种中间表型，与对照组或未经处理的PD组相比没有显著差异，表明联合体治疗后多巴胺能神经元得到部分保留。

最后，使用雄性果蝇评估了存活率。四组之间在存活率上没有发现显著差异。然而，当比较接受和未接受联合体的对照果蝇时，存活率的增加与联合体相关。尽管存活结果不能直接与雌性果蝇比较，但这一结果表明，向黑腹果蝇喂食人类共生细菌的联合体对雄性果蝇的存活没有有害影响。

微生物联合体对脑代谢谱的影响

为了研究微生物联合体是否以与观察到的处理果蝇运动性能改善一致的方式影响脑代谢，我们在第10天对所有实验组的雌性果蝇头部进行了非靶向代谢组学分析。代谢物分布分布的三维主成分分析（PCA）显示样本按表型分组，其中PD+果蝇的谱与PD组分离。所有比较都产生了具有接近1的R2值和合理预测值（Q2）的最佳模型。

NMR分析总共检测到33种代谢物，其中15种在 pairwise 比较中显示出显著差异。PD脑代谢组最为独特，而来自C+和PD+组的代谢组聚集更紧密，表明联合体治疗后部分转向共享的代谢状态。

与能量生产相关的代谢物表现出差异反应。琥珀酸盐水平在联合体处理的果蝇（C+和PD+）中显著增加，表明线粒体功能改善。相比之下，ADP + ATP水平没有因联合体给药而显著改变，表明高能磷酸化合物的变化可能不能完全解释观察到的神经保护作用。类似地，尽管葡萄糖代谢紊乱与PD和其他神经退行性疾病有关，但葡萄糖水平在各实验组中没有显著调节。

关于氨基酸，在PD果蝇中观察到的组氨酸等必需氨基酸水平较低与先前将组氨酸减少与PD临床严重性增加联系起来的报告一致。然而，这种改变并未通过联合体给药恢复。此外，谷氨酰胺水平在PD和C+组中仍然升高，表明微生物暴露在生命早期独立于神经退行性过程影响氨基酸代谢。这些持续的改变表明氨基酸代谢在测试条件下对微生物调节的反应较差。

GABA水平在PD果蝇中与对照组相比适度升高，但未因联合体给药而显著调节。这表明神经递质相关通路可能不是观察到的神经保护作用的主要靶点。

与氧化应激相关的代谢物表现出更强烈的反应。在PD果蝇中升高的蛋氨酸亚砜水平在PD+果蝇中显著降低，表明氧化还原稳态改善和蛋氨酸亚砜还原酶（Msr）系统功能部分恢复。鉴于蛋氨酸氧化在α-突触核蛋白聚集中的作用，这些结果表明联合体给药可能减轻氧化应激相关的蛋白质聚集。此外，通常在PD中升高的GPC水平在治疗后降低，进一步支持了氧化还原平衡的恢复。然而，其他氧化应激相关代谢物，如N-乙酰半胱氨酸和黄尿酸，在PD和PD+果蝇中仍然升高，表明某些通路中持续的氧化还原失衡。

最后，与能量储备和嘌呤代谢相关的代谢物显示出选择性改变。AMP和糖原在C+果蝇中与对照组相比显著降低，并且糖原在PD果蝇中也低于对照组。这些结果表明与疾病和微生物暴露相关的能量储存和转换的改变。总体而言，这些发现表明联合体给药部分恢复了PD果蝇的代谢平衡，影响了涉及能量代谢、氧化应激和神经传递的通路。这支持了代谢物介导的宿主生理调节可能有助于观察到的神经保护作用的观点。

黑腹果蝇微生物组的16S rRNA分析

为了评估微生物联合体是否定植于黑腹果蝇肠道，我们对所有实验组的10天龄雌性果蝇进行了16S rRNA测序。属水平的分类学分类显示各组中醋杆菌属（Acetobacter）占主导地位。对照组和PD组的微生物组成相似，而C+组的微生物组与对照组有显著差异。PD+组也与PD组和C+组有显著差异，表明联合体和疾病模型都导致了微生物组的改变。特别是，与对照果蝇相比，PD+组中的葡萄球菌属（Staphylococcus） spp.和棒状杆菌属（Corynebacterium） spp.更高。

PD+组的香农多样性指数显著高于PD组和对照组。因此，在PD组中用联合体治疗显著增加了肠道微生物组的物种多样性，与未处理组和对照组相比。

我们最后对10天龄果蝇的中肠进行了qPCR分析以确认这些结果。PD+组中L. brevis G2和L. paracasei M38的拷贝数显著高于对照组，表明这些细菌存在于果蝇的中肠中。然而，到第25天时，它们增加的存在消失了。

讨论

本研究中使用的计算模型有助于预测具有神经代谢物生产潜力的微生物联合体。通过模拟代谢通量和群落相互作用，SteadyCom能够识别功能多样的联合体，减少了对广泛经验筛选的需求。尽管半自动化重建缺乏完全策划的GSMM的深度，但它们提供了一个生成可测试假设的实用框架。虽然结果可能因这些限制而不准确，但模拟微生物联合体表明代谢交叉喂养增加了神经代谢物的生产，暗示联合体中代谢中间体的可用性增加了GABA生产。

模型预测与体外验证之间存在良好的一致性。通常，葡萄糖在这些模型中预测了更高的生物量生产，这可能是由于中央代谢得到了更好的策划。AGORA模型比本研究中重建的模型预测了更多产生GABA的细菌，这可能是由于该数据库的改进允许了更好的预测。生物量和神经代谢物FVA在次优群落生长速率下显示出不同的物种丰度和神经代谢物生产，证明了生长和生产之间的权衡。这种权衡是合理的，考虑到群落将其资源用于生物量生产，而GABA生产是与酸应激反应相关的次要过程。交叉喂养分析还表明哪些代谢物在群落水平生产这种分子是必需的，其中谷氨酸、乙酸盐和乳酸盐似乎与GABA合成直接相关。体外GABA筛选支持了单一培养的体外预测，并帮助识别了后续评估的特定产生GABA的联合体。

PD模型重现了该疾病的大部分病理生理学，包括运动缺陷、多巴胺能神经元减少和线粒体能量代谢改变。黑腹果蝇的攀爬能力随着衰老而下降，在前12-15天最大且稳定，然后逐渐下降。对于黑腹果蝇PD模型，攀爬测试证明年轻果蝇的攀爬分数与对照果蝇相似，但在第10天和第25天与对照相比攀爬能力过早丧失。这些结果与其他研究一致，其中表达α-突触核蛋白A30P的黑腹果蝇系比表达野生型或A53T α-突触核蛋白的系更早丧失攀爬能力。有趣的是，我们的发现表明微生物联合体在PD模型中赋予了运动表型拯救，因为它们的攀爬性能接近健康对照果蝇，表明PD相关缺陷得到显著减轻。这些结果可能是联合体中微生物协同相互作用以及产生有益代谢物如乳酸盐、GABA或其他SCFA的结果。

雄性果蝇的存活分析表明，联合体对果蝇寿命没有负面影响，甚至改善了对照果蝇的存活，表明在该模型中人类共生细菌的给药耐受性良好。虽然雄性PD果蝇显示出寿命缩短的趋势，与先前报告的α-突触核蛋白毒性一致，但这种差异未达到统计学显著性，可能是由于减轻应激的环境条件（例如，充足的食物，低密度）或生物变异性。该联合体由人类共生细菌组成，可能无法有效定植其他动物模型。

在使用黑腹果蝇的神经退行性模型中，各种范式下报告了性别特异性差异，特别是在帕金森病（PD）模型中，根据一些研究，雌性表现出相等或更大的韧性。在我们的研究中，存活率在雄性中评估，它们通常更容易患神经退行性变，而行为学和代谢组学分析在雌性中进行。这种设计限制了跨性别的直接比较。

量化果蝇脑中的多巴胺能神经元为PD模型中的神经退行性变提供了一个可靠的读数。先前的研究已经证明，α-Syn突变体中的多巴胺能神经元损失是年龄依赖性的。在这项研究中，第10天时多巴胺能神经元的减少在各组之间没有显示出显著差异。Mohite等人也在第10天未检测到神经退行性变的迹象。然而，在第30天表现出多巴胺能神经元簇的显著变化，支持了我们的结果。在第25天，与对照相比，在PD果蝇中观察到多巴胺能变性。有趣的是，接受联合体的对照组和PD组在多巴胺能神经元数量上没有显示出差异，支持了联合体对抗神经元变性的保护作用。虽然我们不能将这种效应归因于特定的微生物代谢物，但可能涉及几种机制，包括改善的线粒体能量代谢、神经炎症的调节或由联合体产生或稳定的神经代谢物的作用。这些发现与观察到的行为改善一致，并支持微生物干预可以调节PD相关神经生物学结果的假设。

神经退行性疾病是具有不清楚神经元死亡机制的多因素疾病。这些疾病通常以线粒体功能障碍和自由基氧物种水平增加为特征。PD也被描述为一种代谢综合征，鉴于其与氧化还原失衡和能量代谢受损的联系。在我们的研究中，PCA显示样本按表型清晰分组，表明PD突变和联合体给药都显著影响了脑代谢物谱。

关于微生物组，PD果蝇中醋杆菌的丰度略高于对照组，并且与对照相比显示出更高比例的乳杆菌。据报道，在PD果蝇（park突变体）中乙酸细菌的丰度更高，并且在对照果蝇中乳酸菌的比例更高，后者与我们的观察一致。联合体给药降低了醋杆菌的丰度，这在PD组中更为明显。联合体显著增加了对照组和PD组肠道微生物组的多样性，与未处理组相比。在PD组中治疗增加的多样性更为明显，因为疾病倾向于减少肠道微生物组的多样性，与健康组相比。PD组，尤其是PD+组中葡萄球菌的增加是显著的，这可以通过遗传模型更容易被该属定植以及联合体为这些细菌创造了有利的生态位来解释。

qPCR结果检测到PD+组中的L. brevis和L. paracasei表明早期给药使得在幼虫发育期间中肠定植成为可能。它们的存在也表明它们的代谢活动部分解释了PD病理生理学的改善。相比之下，在任何组中都没有鉴定到B. thetaiotaomicron DNA，这可能是由于其更苛刻和狭窄的在果蝇中肠内的生长，其特征是较低的温度（25°C）和较高的氧气浓度。尽管缺乏B. thetaiotaomicron定植，但G2M38亚联合体生产相似数量的GABA，正如我们的体外数据所证明的那样。然而，这项工作没有评估联合体在体内生产多少GABA。虽然我们没有在体内量化GABA或进行代谢示踪，但我们的结果表明，早期接触乳杆菌菌株可以调节肠道组成，并有助于改善PD相关表型。这些发现支持了使用定制联合体靶向微生物组-肠-脑轴的可行性。

我们为联合体在PD模型中的作用机制提出以下假设。G2BtM38微生物联合体在黑腹果蝇PD模型中显示出神经保护作用，如改善的运动和代谢组谱以及部分保留的多巴胺能神经元所证明。黑腹果蝇拥有一个由鞘下胶质细胞形成的结构明确的血脑屏障（BBB），其限制旁细胞扩散并调节代谢物进入大脑。虽然比其脊椎动物对应物更简单，但果蝇BBB执行类似的保护作用，维持神经稳态并保护大脑免受系统波动的影响。在这种背景下，微生物GABA即使是在肠道或血淋巴中产生，也不太可能穿过BBB产生直接的神经效应。然而，微生物代谢产生