原核生物进化塑造长期工程窖泥生态系统中的特化群落：从宏基因组视角解析微生物群落演替与功能优化

本刊推荐：为破解微生物群落长期功能稳定性难题，研究人员聚焦百年中式白酒发酵窖泥生态系统，通过宏基因组学解析原核生物群落时序动态。研究发现窖泥微生物从通用型主导向特化型富集转变，代谢功能从水解潜能转向有机酸代谢强化，并揭示了互营脂肪酸氧化、产甲烷和碳链延伸等关键代谢途径的协同机制。该研究为理性设计高稳定性、功能优化的微生物群落提供了生态学见解。

　　

在微生物工程领域，如何构建长期稳定的功能群落一直是重大挑战。虽然发酵食品系统为微生物生态学研究提供了理想模型，但人们对微生物群落组装和持久性的生态学原理仍认识不足。传统中式浓香型白酒（Chinese strong-flavor liquor, CSFL）发酵系统正是一个历经数百年人工驯化的工程环境，其窖泥中蕴含着复杂且稳定的微生物群落，这些微生物通过与发酵基质的代谢相互作用，赋予白酒独特风味。窖泥微生物群落在连续扰动中发展出不同的演替阶段，形成了从数年到数百年的天然时间序列，为研究原位微生物群落长期动态提供了独特机会。

尽管前人研究揭示了不同窖龄窖泥微生物组的分类和组成变化，但这些生态系统中组装和成熟的功能动态及生态机制仍不完全清楚。以往研究多基于不同窖龄的窖泥快照，而非跟踪微生物群落及其代谢功能的时间演替模式。因此，系统研究窖泥微生物群落随时间的动态变化具有重要意义。

在这项发表于《npj Biofilms and Microbiomes》的研究中，Yan Zeng和Xiaozhong Zhong等研究人员通过基因组分辨宏基因组学技术，结合理化数据，阐明了窖泥微生物组在百年时间尺度上的功能和分类转变。研究团队提出了三个科学假设：原核生物功能潜能遵循由环境过滤和组装过程塑造的演替模式；生态系统水平有机酸代谢与群落成熟的基因组特征相关；特定微生物谱系具有基因组适应性，使其能够实现年龄依赖性优势。解析这些组装和功能优化的驱动因素，将为了解长期人为时间尺度上微生物生态系统发展提供基础见解，并为工程化稳定功能原核生物群落提供策略。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：从国内白酒生产企业采集3年、10年、30年和100年窖龄的120个窖泥样本，进行理化性质分析；采用CTAB法提取总DNA，通过Illumina HiSeq X Ten平台进行测序；使用metaSPAdes进行共组装，通过MetaWRAP流程进行基因组分箱，获得4,082个中等质量宏基因组组装基因组（MAGs）；经去冗余得到634个代表性MAGs（rMAGs），利用GTDBtk进行 taxonomy 注释；通过KofamKOALA、CAZyme数据库和MEROPS数据库等进行功能注释和代谢重建；采用随机矩阵理论（RMT）构建微生物关联网络，并通过结构方程模型（SEM）分析生态驱动因素。

研究结果

长期白酒发酵使窖泥营养富集

研究人员观察到在长期CSFL生产过程中，窖泥理化性质随使用时间发生显著变化。pH从弱碱性（P3）降至弱酸性（P100），而有机质（OM）、溶解有机碳（DOC）、总碳（TC）和总氮（TN）显著增加。短链脂肪酸（SCFAs）呈现年龄依赖性积累：乳酸、乙酸和丁酸在P100达到峰值；丙酸和己酸稳步增加。在无机离子中，NH₄⁺、Cl^-和K⁺随着窖龄显著积累。离子的积累导致老窖的EC显著增加。Pearson相关分析揭示了窖泥理化性质间的显著相关性。

宏基因组重建揭示窖泥中的新微生物

120个窖泥样本的宏基因组学分析产生了4,082个中等质量的MAGs（CheckM估计完整性≥70%，污染≤5%）。去冗余后获得634个代表性MAGs（rMAGs），包括569个（89.74%）细菌和65个（10.26%）古菌rMAGs。细菌rMAGs主要属于Firmicutes A（175个rMAGs）、Bacteroidota（86个）、Firmicutes G（49个）和Firmicutes B（46个），而古菌rMAGs主要为Halobacteriota（30个）、Thermoplasmatota（20个）和Methanobacteriota（15个）。

在634个rMAGs中，只有198个（31.23%）与已知属匹配，其余基因组分布在未培养谱系中：属水平（162个rMAGs，25.55%）、科水平（132个，20.82%）、目水平（64个，10.09%）、纲水平（72个，11.36%）和门水平（6个，0.95%）。这表明与GTDBtk数据库相比，大多数rMAGs是新奇的。Venn图显示不同窖龄rMAGs的重叠情况：总rMAGs从P3的292个减少到P30的221个，然后增加到P100的309个，反映了窖泥原核生物丰富度的波动。

78个rMAGs的核心微生物组在所有窖龄中持续存在，占总相对丰度的68.23-79.09%。核心rMAGs主要是Bacteroidota（13个）、Halobacteriota（5个）、Firmicutes A（25个）和Firmicutes G（5个）。年龄特异性rMAGs数量为P3（131个）、P10（102个）、P30（32个）和P100（122个），贡献了14.2-19.0%的相对丰度。独特rMAGs主要属于Chloroflexota、Proteobacteria和Bacteroidota。

原核生物随窖龄的动态变化以特定属为标志

分类学分析揭示了窖泥群落随窖龄的动态组成变化。细菌优势逐渐下降（64.90-75.38%相对丰度），而古菌丰度从25.31%持续增加到32.34%。优势细菌门为Bacteroidota（16.3-38.50%）、Firmicutes A（5.52-15.40%）、Firmicutes G（2.51-18.58%）、Firmicutes B（3.47-11.37%）和Chloroflexota（0.34-13.77%）。古菌属于Halobacteriota（18.65-24.30%）、Methanobacteriota（4.09-11.48%）和Thermoplasmatota（0.35-1.88%）。

时间群落动态揭示了明显的演替模式。相对丰度谱显示Methanoculleus、Proteiniphilum和Petrimonas是优势分类群。Alpha多样性分析表明P10的Shannon指数显著高于P30和P100（p<0.01），而基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）证实了显著的年龄相关组成差异（R²=0.11，p<0.001）。这些结果共同表明窖泥微生物群落存在明显的时间演替模式，其特征是早期多样性高峰，随后在老窖中选择压力增加。线性回归确定了关键的年龄相关属，包括Proteiniphilum（r²=0.2，FDR<0.001）、Petrimonas（r²=0.17，FDR<0.001）、UBA4882（r²=0.08，FDR<0.001）、Syner-03（r²=0.07，FDR<0.001）、SR-FBR-E99（r²=0.09，FDR<0.001）、Methanobacterium A（r²=0.16，FDR<0.001）、Caproicibacter（r²=0.1，FDR<0.001）、UBA4871（r²=0.23，FDR<0.001）和Pseudomonas_E（r²=0.1，FDR<0.001）。

理化性质与前20个属显示显著相关性。Proteiniphilum、Petrimonas、T78、Methanothrix、Pseudomonas E、Syner-03和SR-FBR-E99与OM和离子呈负相关，而Methanoculleus、Methanobacterium A、Caprobacter、Methanobacterium C、UBA4871、Methanosarcina、Syntrophaceticus、Sedimentibacter和UBA4844与营养水平正相关。随机森林模型确定了23个年龄判别属，实现了89.77%的方差解释。关键预测分类群包括Methanobacterium_A（增加）和Proteiniphilum（减少），突出了它们作为成熟生物标志物的实用性。

长期发酵降低窖泥聚合物降解能力

代谢途径重建采用严格标准，要求酶系统和途径完整性≥80%，并基于KEGG模块完整性进行人工筛选。通过基因丰度加权指标量化代谢能力，Spearman分析揭示了显著的年龄相关性。

为阐明聚合物降解，研究人员分析了催化大分子水解的肽酶、脂肪酶和碳水化合物活性酶（CAZyme）的多样性和存在情况。聚合物降解基因广泛分布在各种门中，包括Bacteroidota、Firmicutes A、Firmicutes G、Armatimonadota、Planctomycetota和Verrucomicrobiota。然而，考虑到丰度，CAZymes主要由Bacteroidota（如MAG246.1、MAG254.1）、Firmicutes A（MAG554.1、MAG545.1）、Firmicutes G（MAG300.1、MAG109.1）和Armatimonadota编码。这些门可能是窖泥中主要的聚合物降解者。值得注意的是，脂肪酶（rho=-0.38，FDR<0.001）、糖苷水解酶（GH，rho=-0.50，FDR<0.001）、碳水化合物酯酶（CE，rho=-0.37，FDR<0.001）、碳水化合物结合模块（CBM，rho=-0.46，FDR<0.001）和多糖裂解酶（PL，rho=-0.4，FDR<0.001）的能力随窖龄下降，而辅助活性（AA，rho=0.46，FDR<0.001）增加。

短链有机酸代谢能力随窖龄增加

乳酸、乙酸、丙酸和丁酸是厌氧聚合物水解的主要副产物，也是CSFL中的重要风味化合物。观察到通过乙酰-CoA进行乙醇和乳酸代谢的高潜力，含有这两种途径的rMAGs相对丰度为43%。乳酸代谢者丰度随窖龄显著下降，而酒精代谢能力稳定。Bacteroidota属Petrimonas和Proteiniphilum具有最高的乳酸分解代谢潜力，随时间下降。相比之下，Firmicutes A属Caproicibacter、Sedimentibacter和各种未培养成员在老窖中成为主要的乳酸利用者。尽管酒精降解稳定，但优势酒精利用属从年轻窖（P3、P10）的Petrimonas、未培养SR-FBR-E99和Syner-03转变为老窖（P30、P100）的Pseudomonas E、Caproicibacter和Caproicibacterium。

研究人员检查了窖泥原核生物中的脂肪酸生物合成微生物，因为短链脂肪酸（SCFAs）是重要的中间体和预期的CSFL代谢物。在230个rMAGs中鉴定到丁酸生物合成途径，在四个窖龄中占34.21-36.92%。虽然丁酸生物合成者的相对丰度保持稳定，但它们的组成随窖龄显著变化。具体而言，Petrimonas、未培养T78和UBA4882成员在P3中主导丁酸生物合成组，但在P100中减少，而Caproicibacter、Caproicibacterium、Sedimentibacter和Pseudomonas E在P100中增加。关于脂肪酸链延伸，有两种途径获得更长脂肪酸：脂肪酸生物合成（FAB）途径和反向β氧化（RBO）途径。研究人员观察到编码FAB途径的基因组（176个rMAGs）丰度（8.70-25.59%）随窖龄显著增加。大多数负责FAB途径的rMAGs属于未培养UBA4882、Caproicibacterium、Caproicibacter和Pseudomonas E。相反，RBO途径在四个窖龄中分别观察到67.64%和51.00%的基因组编码，其中大多数属于Pseudomonas E、未培养UBA4882和Caproicibacterium。RBO途径的丰度与窖龄呈负相关（rho=-0.32，FDR<0.001），而FAB途径显著增加（rho=0.46，FDR<0.001），表明FAB是窖泥原核生物中碳链延伸的主要途径。

与产甲烷伙伴的SCFAs互营氧化被认为是厌氧过程中的关键步骤。根据升高的丁酸和乙酸浓度，窖泥原核生物表现出随窖龄增加的互营丁酸（rho=0.20，FDR<0.05）和乙酸（rho=0.28，FDR<0.01）氧化潜力，而丙酸降解潜力下降（rho=-0.24，FDR<0.05）。研究人员确定了99个具有丁酸氧化途径的rMAGs，相对丰度从P3的16.77%增加到P100的23.63%。Petrimonas、Caproicibacterium、UBA4844和UBA5389成员在每个窖龄主导丁酸氧化组，而Pseudomonas E和未培养T78的物种在P100中显著增加。丙酸降解组包括72个rMAGs，这些rMAGs的相对丰度从P3的23.38%下降到P100的16.46%，其中Petrimonas、Proteiniphilum和未培养UBA4882主要贡献丙酸氧化代谢能力。对于互营乙酸氧化，27个和111个rMAGs分别编码Wood-Ljungdahl（WLP）和甘氨酸裂解途径（GCP）。平均相对丰度WLP为3.01%，GCP为10.61%，表明GCP占主导地位。Syntrophaceticus成员，包括已知的乙酸氧化剂S. schinikii（MAG106.1）是主要的WLP微生物。关于GCP，研究人员发现Sedimentibacter、未培养UBA4844和UBA4975是丰富的属。此外，25个WLP和104个GCP rMAGs被鉴定为未培养，表明窖泥中存在丰富的新颖乙酸氧化剂。

在古菌rMAGs中普遍鉴定到产甲烷途径。37个古菌中的氢营养途径最为突出，从P3的17.38%显著增加到P100的29.03%（rho=0.35，FDR<0.001）。Methanoculleus（9个rMAGs）、Methanobacterium C（5个rMAGs）和混合营养产甲烷菌Methanosarcina成员（9个rMAGs）主要贡献四个窖龄的氢营养产甲烷作用。Methanoculleus的相对丰度首先从P3的8.78%上升到P10的17.79%，然后下降到P100的14.54%。值得注意的是，Methanobacterium A（2个rMAGs）随窖龄从0%显著增加到7.82%。乙酸营养产甲烷菌的比例从P3的9.32%波动到P100的5.07%，与窖龄无显著相关性。Methanothrix（2个rMAGs）和Methanosarcina（9个rMAGs）是丰富的乙酸营养产甲烷菌。研究人员还鉴定了社区中甲基化合物（即甲醇、二甲胺和一甲胺）代谢产生甲烷。甲基营养产甲烷能力随窖龄从4.86%增加到7.61%，其中Methanobacterium C、Methanosarcina和Methanobacterium A主导该组。此外，20个Thermoplasmatota rMAGs被鉴定为甲基营养菌，包括17个未培养Methanomassilicoccales。补充产甲烷作用，各种门编码支持能量和代谢功能。各种电子传递模块的存在突出了能量守恒途径在CSFL发酵中的重要性。

塑造原核生物结构和功能的生态因素

通过Mantel检验和Pearson相关分析生态驱动因素，揭示窖龄是分类学（rho=0.39，P<0.001）和功能（rho=0.22，P<0.001）变异的最强预测因子。钾与分类学（rho=0.24，p<0.001）和功能（rho=0.22，p<0.001）显示显著相关性。微生物群落与MC、EC、NH₄⁺、TN、Cl^-和DIC（p<0.01）发生中度相关。与SO₄^2-、TC、DOC、Na⁺、PO₄^3-、有机酸和C/N比（p>0.05）发生弱/不显著关联。PCoA证实了分类学（R²=0.11，P<0.001）和功能结构的显著年龄相关分化。此外，观察到组成（R²=0.16，P<0.001）和功能（R²=0.13，P<0.001）相似性与窖龄差距的显著时间衰减关系。尽管相似性随窖龄差距增加而下降，但结果表明在窖池发展过程中，窖泥原核生物存在高分类学变异性但功能结构相似。

采用结构方程模型（SEM）评估群落组成和环境之间的多变量关系。研究结果表明，可能与营养富集相关的己酸，直接受到MC（rho=0.42，P<0.001）、EC（rho=0.43，P<0.001）、pH（rho=0.39，P<0.001）和Cl^-（rho=-0.27，P<0.05）的直接影响。通过pit age解释了9%的分类学变异。

为了深入了解微生物组装，研究人员进一步构建了基于随机矩阵理论（RMT）的Spearman等级相关网络，以确定窖泥原核生物成员之间的潜在生态相互作用。网络分析揭示了变化的相互作用模式。尽管P100中MAG数据集更大，但网络复杂性下降，表明随着年龄增长功能整合增强。负相关比例从P3的52.22%上升到P10的67.57%，然后下降到P30的59.09%和P100的57.14%，表明随着营养富集，竞争变得更加频繁，这与"饥饿游戏"假说一致。尽管营养在P100中继续积累，但正相关增加到42.86%，意味着在环境压力下合作增强有助于生存。

研究结论与意义

本研究通过百年窖泥时间序列的系统宏基因组分析，增进了我们对传统发酵生态系统中结构-功能关系的理解。研究阐明了窖池生态系统生态学，同时建立了管理时间序列作为研究微生物群落进化的模型系统。这些发现为微生物群落工程提供了关键见解，揭示了三个关键原则：功能冗余使尽管分类周转仍保持稳定性；代谢专业化随群落成熟而增加；环境过滤驱动预测的演替模式。

在复杂的厌氧微生物网络中，交叉喂养级联可能在共享池中建立种间营养循环，实现连续周转，平衡化学计量并稳定群落。代谢重建确定了四个控制碳流的相互作用功能组：水解细菌（HB）、脂肪酸链延伸细菌（FCEB）、互营脂肪酸氧化细菌（SFOB）和产甲烷菌。HB最丰富地编码肽酶、脂肪酶和CAZymes，是将生物聚合物水解为单体，然后发酵成H₂、CO₂和SCFAs的通用菌。FCEB通过链延伸将SCFAs转化为更长脂肪酸（主要是丁酸、己酸）， longer chain fatty acids通过浓度梯度扩散到酒醅中，为CSFL提供风味化合物，同时降低窖泥有机酸浓度。SFOB-产甲烷菌耦合去除SCFAs产生CH₄，并减少群落的酸压力。通过整合脂肪酸链延伸和互营产甲烷作用，群落快速去除有机酸，防止长期CSFL发酵过程中的强烈酸化，保证窖泥生态系统的稳定性。

宏基因组分析有助于各种厌氧环境中新细菌的鉴定。本研究发现近70%的rMAGs（634个中的436个）被定义为未培养物种，表明窖泥中存在大量新颖的厌氧微生物。大多数新颖的SFOBs属于Firmicutes谱系类别，其中包含众所周知的SFOBs，如S. schinkii和S. methylbutymatica。在未分类物种中发现了脂肪酸生物合成途径。产甲烷作用使用氧化的碳（如CO₂）作为最终电子受体，对厌氧环境中的碳循环至关重要。本研究发现了17个编码甲基营养产甲烷途径的rMAGs，属于未培养的Methanomassilicoccales目。

窖泥群落主要受当地理化条件的影响。与先前研究一致，我们的结果表明窖泥特性在长期CSFL发酵过程中显示营养富集但酸化和盐碱化。代谢交叉喂养级联相应转变，反映在分类和功能演替模式中。研究人员提出了一个概念模型来理解窖泥微生物随窖龄增加的演替模式：研究发现从"通用型主导"到"特化型富集"群落的转变。早期原核生物表现出高功能多样性，特别是在水解能力方面，使其能够利用多样聚合物底物。成熟群落显示出有机酸生产和利用的代谢潜力增强，表明了对发酵环境选择压力的功能特化。

在窖泥发展的早期阶段（P3），研究人员观察到低碳可用性， coupled with高多样性和合作相互作用。这与最近研究提出的"饥饿游戏"假说一致，表明营养稀缺促进有效资源利用的合作。初始群落表现出功能多样性，以丰富的水解潜力为特征，这是早期生态系统的常见特征。这种通用策略使群落能够利用多样聚合物底物，启动产生SCFAs、氨基酸并最终产生长链脂肪酸、CO₂和甲烷的复杂发酵级联。

随着窖泥在数十年的CSFL发酵过程中成熟，研究人员观察到群落组成和功能的显著转变。发酵代谢物的积累与水解细菌（HB）相对丰度下降以及短链脂肪酸氧化细菌（SFOB）和氢营养产甲烷菌增加相关。这种转变伴随着负相关的增加，与"饥饿游戏"假说预测营养丰富环境中更频繁竞争一致。

研究人员提出这种转变代表了从通用型主导到特化型富集群落的转变，证据在于：（i）编码水解酶的基因相对丰度下降和参与有机酸代谢的基因增加；（ii）分类学从HB如Proteiniphilum和Petrimonas转向特化生物，如FCEB Caproicibacter、互营细菌Syntrophomonas和氢营养产甲烷菌Methanoculleus。这种特化型富集群落具有增强的有机酸周转能力，可能在维持pH稳定性和群落韧性方面发挥关键作用。

在深度老化阶段，尽管持续酸化（pH下降）和HB进一步下降，研究人员观察到物种多样性增加和正相关。这种与"饥饿游戏"假说的明显矛盾表明，其他因素（如pH和盐度等环境压力）显著影响成熟工程原核生物中的群落动态。结构方程建模（SEM）证实了这些压力因素对微生物群落组成的直接影响。

本研究获得的见解对原核生物工程具有广泛意义。虽然保守的途径完整性阈值确保了稳健的功能预测，但研究人员承认这种方法可能低估了分布式代谢网络在634个MAGs中的普遍性。然而，功能公会之间代谢交接的系统表征为工程稳定高效的微生物群落建立了宝贵框架。过程流从水解器通过碳延伸器和互营菌到产甲烷菌。这里生成的全面基因组库不仅能够实现靶向培养和相互作用研究，而且为未来使用先进技术（如基因组尺度代谢建模和蛋白质组解析网络推断）的研究奠定了基础。这些发现和资源对生物技术应用具有深远影响，从优化工业发酵过程到增强环境修复系统，最终推进我们利用和工程复杂微生物群落实现可持续解决方案的能力。