多尺度蛋白质组网络模型揭示阿尔茨海默病发病机制中的关键蛋白驱动因子与神经胶质-神经元互作网络

本研究针对阿尔茨海默病(AD)分子机制不明确的难题，通过整合大规模蛋白质组与遗传数据，构建了多尺度蛋白质网络模型。研究人员发现了一个与AD最强相关的神经胶质-神经元共表达子网络，鉴定出AHNAK等关键驱动蛋白，实验证实下调AHNAK可降低pTau和Aβ水平。该研究为开发AD创新治疗策略提供了重要理论基础。

　　

阿尔茨海默病作为最常见的痴呆类型，其分子机制至今仍未完全阐明。尽管lecanemab和aducanumab等药物在早期AD患者中显示出一定疗效，但大多数实验性药物仍然以失败告终。这种神经退行性疾病的病理特征包括神经原纤维缠结、营养不良性神经突、丰富的细胞外Aβ纤维和炎症反应，但散发性AD特别是晚发性AD的病因仍然知之甚少。

多组学技术为解析复杂疾病的关键通路和驱动因子提供了强大工具。其中蛋白质组学尤为重要，因为蛋白质表达的改变比遗传或转录组水平的变化更直接地与表型变异相关。然而，目前仅有有限数量的人脑组织蛋白质组研究，且最易受AD影响的大脑区域——海马旁回(PHG)的大规模深度蛋白质组分析仍然缺乏。

为此，研究人员开展了这项开创性研究，通过对AD易感脑区进行大规模匹配的蛋白质组和遗传数据整合，构建了多尺度蛋白质组网络模型，揭示了详细的蛋白质相互作用结构，并识别了参与AD进展的推定关键驱动蛋白(KDPs)。该研究成果已发表在顶级期刊《Cell》上。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1)对MSBB队列198例死后人脑PHG区域进行深度蛋白质组分析；2)整合ROSMAP和BLSA队列的蛋白质组与转录组数据；3)采用多尺度嵌入式基因共表达网络分析(MEGENA)构建蛋白质共表达网络；4)应用Bayesian因果网络分析预测关键驱动蛋白；5)利用人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的星形胶质细胞与小鼠神经元共培养系统进行功能验证。

研究结果

开发来自185个AD和非AD大脑海马旁回样本的蛋白质组数据队列

研究人员对MSBB队列中185个死后AD和非AD大脑的PHG进行了蛋白质组分析，共识别出12,147个独特蛋白质异构体，这些蛋白质由9,272个独特基因编码。蛋白质表达水平经过性别、种族、死亡年龄、死后间隔(PMI)和批次等协变量调整后，用于后续分析。

识别AD相关蛋白

研究人员根据疾病严重程度将受试者分为三组，分别代表从正常到中度再到高度严重的AD病理和痴呆状态。通过比较不同严重程度组别，识别出超过1,000个差异表达蛋白(DEPs)，约占评估总蛋白的10%。有趣的是，70%以上的DEPs在严重AD病理情况下上调表达。这些DEPs在AD发病机制中富集于重要的Gene Ontology通路，如下调的DEP特征富集在神经元和突触功能，而上调的DEP特征富集在免疫反应。

CDR和CERAD捕捉AD病理的不同方面

临床痴呆评分(CDR)和阿尔茨海默病登记联盟(CERAD)评分分别评估痴呆严重程度和基于神经病理学标准的AD病例对照状态。研究发现，虽然基于CDR的DEPs与基于CERAD的有显著重叠，但仍有大量DEPs独特地与CDR或CERAD相关，表明一些异常表达的导致AD认知障碍的蛋白质并不直接与主要神经病理学病变相关。

APOE基因型在AD相关蛋白质组中的关键作用

APOE基因型是AD的主要风险因素，其中APOE ε4/ε4(APOE 44)基因型具有特别有害的影响。研究发现APOE4-AD与APOE33-NL之间存在244个下调和1,114个上调的DEPs，而APOE33-AD与APOE33-NL之间仅有42个DEPs。值得注意的是，AHNAK蛋白表达从APOE33-NL到APOE33-AD再到APOE4-AD逐步增加，表明APOE4基因型与疾病状态之间存在潜在相互作用，可能加剧AD病理进展。

性别共享和特异的AD相关蛋白质组

研究发现男性DefiniteAD与NL相比有142个下调和434个上调的DEPs，女性有220个下调和784个上调的DEPs。虽然男性和女性DEP特征有显著重叠，但仍有大量DEPs是各自性别特有的，表明与AD相关的蛋白质组变化存在明显的性别特异性差异。

DEP特征在独立AD蛋白质组数据集和AD小鼠模型中得到复制

MSBB蛋白质组数据的DEP特征与ROSMAP前额叶皮层(PFC)和BLSA队列的独立蛋白质组数据集中的DEP特征显著重叠。此外，在5xFAD小鼠模型中也观察到MSBB AD DEP特征的强烈富集，进一步证明了这些人DEP特征的高度可重复性和与AD发病机制的强相关性。

蛋白质共表达网络分析揭示与AD相关的蛋白质模块

通过多尺度嵌入式基因共表达网络分析(MEGENA)，研究人员构建了一个蛋白质共表达网络，识别出386个共表达蛋白质模块。在这些模块中，排名前30的AD相关模块中有5个(M5、M2、M120和M186)富集下调的DEP特征，而其他25个富集上调的DEP特征。这些AD相关模块基于人脑细胞类型特异性标记特征的富集具有细胞类型特异性。

值得注意的是，模块M3捕捉了下调神经元基因、激活星形胶质细胞基因和激活小胶质细胞基因之间的相互作用，反映了神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的通讯。在这个神经胶质-神经元网络中，AHNAK作为一个顶级驱动蛋白，在AD中上调表达，并且与神经病理学特征和认知功能显著相关。

识别和表征PHG蛋白质组特异性模块

模块保守性分析显示，在MSBB队列的386个PHG蛋白质模块中，148个(38.3%)、47个(12.2%)和40个(10.4%)模块分别在ROSMAP PFC蛋白质、MSBB PHG基因和ROSMAP PFC基因网络中保守。重要的是，10个模块(M2、M23、M56、M278、M476、M31、M512、M486、M145和M511)在其他3个网络中都不保守，因此是PHG蛋白质共表达网络特有的。

Bayesian因果蛋白质网络揭示AD的KDPs

通过整合PHG蛋白质组数据以及匹配的遗传数据，研究人员构建了一个全局Bayesian因果网络，揭示了蛋白质之间潜在的调控关系。通过关键驱动分析(KDA)，识别出580个KDPs，对应471个基因(平均每个基因1.23个蛋白质异构体)。其中moesin蛋白(MSN)和PRDX6是前两个最重要的KDPs。

有趣的是，72%的KDPs(340个中的469个)在AD研究中尚未充分研究，其中11个蛋白质(AHNAK、RPH3A、EZR、PLEC、OLFM3、NUMA1、LIMS1、DTNA、PLCB1、NDUFS1和PLCD1)是前30个KDPs。值得注意的是，105个KDPs尚未在AD中进行研究。这些结果表明预测的KDPs不仅包括已确立的AD相关靶点，如MSN，还包括在AD背景下研究最少或以前未研究的蛋白质。

顶级AD的KDPs蛋白质表达的实验验证

研究人员通过定量毛细管Western assays(Wes)或酶联免疫吸附测定(ELISA)验证了前7个排名最高的KDPs的表达，所有这些KDPs都表现出与蛋白质组分析中观察到的表达模式一致(即上调和下调)。

人iPSC衍生脑细胞中AHNAK的下调可挽救神经退行性变

选择AHNAK进行进一步功能研究，因为它在KDP列表中排名高，且在AD研究中研究最少。在因果和共表达蛋白质网络中，AD相关的DEPs在AHNAK中心的子网络中高度富集。AHNAK在AD中上调表达，并且不仅与神经病理学特征而且与认知功能显著相关。

实验结果表明，AHNAK短发夹RNA(shRNA)处理下调了其APOE 44 AD星形胶质细胞培养物中的蛋白质表达。与对照组相比，AHNAK下调的APOE 44 AD星形胶质细胞培养物中pTau水平降低。当与神经元共培养时，AHNAK shRNA处理的星形胶质细胞共培养物中pTau水平也一致降低。这些发现表明，星形胶质细胞中AHNAK的下调通过降低星形胶质细胞和星形胶质细胞/神经元共培养物中的pTau水平，在促进神经元活动和维持神经元功能方面提供了有益效果。

AHNAK调控的iPSC蛋白质特征在其蛋白质网络邻域中富集

AHNAK下调后，研究人员观察到数百个具有显著表达变化的蛋白质。基因集富集分析(GSEA)显示，AHNAK扰动的蛋白质特征在AHNAK中心的蛋白质网络邻域中富集。基于AHNAK扰动特征，进一步构建了一个AHNAK调控的信号通路图，涉及代谢过程、MAPK信号、炎症和脂质代谢之间的相互作用，所有这些都与AD或认知功能相关。

研究结论与意义

这项研究通过整合匹配的遗传、蛋白质组、临床和病理数据，开发了AD的多尺度蛋白质组调控网络模型。研究人员系统地识别了参与AD发病机制的共表达蛋白质模块和蛋白质网络驱动因子，特别强调了一个捕捉神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞之间相互作用的子网络。

研究发现不仅揭示了已知的AD相关靶点，如MSN和PRDX6，还发现了大量在AD研究中尚未充分探索的新候选靶点。特别是AHNAK作为神经胶质-神经元网络中的顶级驱动蛋白，通过实验验证证实其在AD病理机制中的重要作用。

这些发现为揭示AD潜在的分子机制奠定了基础，并推动了针对AD的下一代治疗方法的开发。研究所构建的多尺度蛋白质组网络模型为理解复杂疾病提供了新范式，不仅适用于AD，也可能为其他神经退行性疾病的研究提供重要借鉴。

该研究的局限性在于大多数发现需要进一步的生物学和实验验证。即使对于AHNAK，也需要体内研究来阐明其在认知、记忆和AD发病机制中的作用。未来研究将继续探索这些关键驱动蛋白的功能机制，为开发有效的AD治疗策略提供更多证据支持。