星形胶质细胞通过特化叶片结构域功能整合多个突触

本研究通过结合高分辨率三维电子显微镜和双光子钙成像技术，揭示了星形胶质细胞叶片结构域的组织特征和功能特性。研究人员发现这些叶片结构域通过间隙连接形成功能单元，包裹约90%的突触集群，并含有表达IP3R1的微小内质网囊泡。神经元活动能触发IP3R1介导的局部Ca2+信号，这些复杂事件反映了来自不同神经元输入的整合，表明星形胶质细胞叶片组织可能通过Ca2+信号协调不同时空尺度活动的多个突触和回路，执行与神经元不同的计算。这项研究为理解神经环路中的星形胶质细胞-神经元相互作用提供了新的结构功能框架。

　　

大脑中的星形胶质细胞曾经被认为仅仅是填充神经元的"胶水"细胞，但近几十年的研究彻底改变了这一认知。科学家们发现这些细胞不仅与血管和突触形成特化的接触区域，还能通过钙信号活动主动参与神经信息的处理和调控。特别是在星形胶质细胞与突触的界面，存在着被称为"三重突触"的结构，其中星形胶质细胞的薄片状突起包裹着突触，形成功能单元。然而，这一领域的深入研究一直面临技术挑战，特别是对星形胶质细胞超微结构的完整解析以及对其局部钙信号活动的精确监测。

长期以来，研究人员对星形胶质细胞如何通过钙信号影响突触功能存在争议。一些研究表明，星形胶质细胞的钙微域是由内质网(ER)上的IP₃受体(IP₃R)介导的，能够调节突触前强度和树突棘稳定性；而另一些研究则认为这些信号主要与线粒体活动相关，且对IP₃R2基因敲除不敏感。更根本的问题是，星形胶质细胞在突触界面处的内质网结构是否存在，以及它们如何组织起来响应神经活动，这些关键问题一直没有得到彻底解答。

为了填补这一空白，由Lucas Benoit、Ines Hristovska和Nicolas Liaudet等研究人员领导的研究团队开展了一项综合性研究，结合了高压冷冻电子显微镜、聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)和三维双光子钙成像等先进技术，对海马齿状回分子层中的星形胶质细胞突触界面进行了详细解析。他们的研究成果发表在《Cell》期刊上，为我们理解星形胶质细胞在神经环路中的功能提供了全新视角。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：使用高压冷冻和冷冻替代技术制备样品，确保星形胶质细胞精细结构的完整保存；通过FIB-SEM获取各向同性4纳米体素分辨率的三维图像堆栈，实现对星形胶质细胞及其细胞器的精确分割和重建；利用条件性表达膜靶向GCaMP6f的转基因小鼠品系，结合线粒体荧光标记病毒，实现对星形胶质细胞叶片结构域的特异性钙成像；开发新型三维钙成像分析方法SigROIfree，能够准确识别和分类不同细胞器来源的钙信号事件；采用免疫金标记和基因敲除策略验证IP₃受体亚型在钙信号产生中的作用。研究使用的样本来自成年小鼠海马脑片。

星形胶质细胞叶片区室的单位和连接域

通过FIB-SEM技术，研究人员重建了星形胶质细胞的完整片段，包括细胞体、主干过程和周边细密分支。他们发现星形胶质细胞形态高度复杂，但可以明确区分两种结构群：直径大于250纳米的主干过程(shafts)和直径小于等于250纳米的薄片状吻合片层(leaflets)。这两种结构的关键区别在于表面积与体积比(SVR)的十倍急剧增加，反映了形态的复杂化。

叶片可以从星形胶质细胞的不同位置起源，包括大小主干过程，偶尔直接从细胞体发出。小叶片的体积异质性很大，范围从10^-3到大于10立方微米。小型叶片有单一连接与主干过程相连，而大型叶片(大于0.221立方微米)有多个连接(最多3个)，表明它们实际上是更小叶片集合体而非不同类别的叶片。对这些大型叶片的仔细观察发现了具有间隙连接特征的细胞质不连续性，通过连接蛋白43(connexin-43)的免疫金标记证实了这些确实是间隙连接。

研究人员提出，通过单一连接与主干过程相连的叶片形成单个"叶片单元"，而通过间隙连接相互连接并通过多个连接与主干过程相连的叶片形成"叶片域"。这种组织方式使得星形胶质细胞能够形成大型互连域，通常涉及相邻叶片，或偶尔涉及叶片和主干过程。

叶片可以接触多个突触：三重突触网络

在研究人员分割突触的子体积中，98%的星形胶质细胞元素与突触的接触涉及叶片(距离≤30纳米)，而与主干过程的直接接触有限。这表明星形胶质细胞与突触的接触高度极化分布。

星形胶质细胞围绕突触的组织通常不符合电子显微镜图像和概念框架中描述的单个体三重突触。实际上，一个叶片经常提供一个嵌入多个突触的基质。虽然一些叶片没有明显的突触接触，可能是尚未与突触接触的丝状伪足样结构，但大多数叶片嵌入的数量与体积成比例的突触：小叶片嵌入单个或少数突触，而大叶片(可能是叶片域)嵌入大量突触。

总体而言，只有10%的突触处于符合三重突触模型的配置中，即一个突触及其相关叶片。相反，90%的突触是与共同叶片相互作用的突触集群的一部分。从星形胶质细胞的角度看，45%的叶片与单个突触相关，其余55%围绕多个突触，最常见的是2-4个，但也经常是5-10个。有时研究人员观察到大型叶片域包含10-50个突触，在一个特殊情况下甚至包含101个突触。鉴于这种结构组织，研究人员提出将三重突触的概念扩展到"三重突触网络"。

小叶中存在小尺寸内质网

研究人员接下来检查了叶片的细胞器组成。他们发现，在线粒体存在于从细胞体到细过程的星形胶质细胞骨干中，但大部分被排除在叶片之外。星形胶质细胞主干内最后一个线粒体前哨因此标志着与叶片区室的边界。

同样，与线粒体紧密相关的具有小管和片的复杂ER(c-ER)结构在整个主干中可见，但在叶片中未见。其中10%在边界处呈细管形状，仅穿透叶片的初始段。然而，在叶片内部，研究人员发现了一种不与线粒体相关的替代型ER的存在，由分布在整个叶片体积中的微小结构组成，他们称之为"孤立ER"(i-ER)。

i-ER结构通常由单个50纳米大的囊泡组成，偶尔由几个组成，平均体积比c-ER结构小约100倍(i-ER:0.0036±0.0054立方微米；c-ER:0.323±0.122立方微米)。在这些囊泡上，研究人员观察到≥80%存在核糖体，支持i-ER在蛋白质合成和局部翻译中的作用。确实，这一特征加上囊泡的伸长形态和50纳米厚度，使研究人员明确将它们归属于ER"网络"。偶尔，研究人员观察到i-ER与质膜融合，表明i-ER在缺乏适当局部高尔基体 apparatus的情况下在蛋白质分泌或质膜跨膜插入中起作用。

通过检查整个三维堆栈，研究人员发现微小的i-ER结构在叶片中富集：叶片容纳了79.62%±7.97%的它们，而仅占分割星形胶质细胞体积的43.96%±11.79%，表明i-ER可能承担叶片特异性功能。

i-ER表达用于突触附近钙信号的IP₃受体

与上述观察一致，研究人员发现容纳的ER结构(包括c-ER和i-ER)数量与叶片的体积相关(Spearman检验:r=0.4951,p<0.001)：最小的叶片包含0-1个ER，中等大小的包含3-4个，大型叶片域最多包含7个。i-ER囊泡通常位于突触附近，由于嵌入叶片的突触数量也与叶片的体积相关，i-ER结构和突触似乎按比例存在于叶片中。

此外，包含ER结构的叶片平均比没有ER的叶片多容纳3.5倍的突触(Mann-Whitney检验;p<0.0001)。这些数据表明，ER结构可能在叶片中完成与相关突触相关的特定功能，并且它们在叶片中的分布是协调的三重组织的一部分， underlying 突触和星形胶质细胞结构之间的功能相互作用。

研究人员接下来通过使用泛IP₃Rs抗体的免疫金标记，研究了i-ER囊泡是否具有钙信号能力。为了明确识别i-ER结构，他们将预嵌入标记与FIB-SEM成像相结合。他们在叶片的c-ER结构和微小i-ER囊泡上检测到IP₃R特异性免疫反应性。

然后他们测量了最近的i-ER或c-ER结构与 bordering 突触间隙的星形胶质细胞质膜之间的欧几里得距离，IP₃释放Gq-GPCRs位于此处。这个距离，607±25纳米，尽管低估了真实距离(用测地线测量更好计算)，仍然与理论IP₃扩散参数和信使触发钙信号的能力兼容。此外，他们测量了叶片内两个ER结构之间的平均相互距离，573±62纳米，这与通过钙诱导钙释放过程在ER结构之间传播钙信号兼容。因此，叶片域内的i-ER囊泡可能是突触附近的主要通信前哨，触发局部钙信号或充当促进其通过星形胶质细胞ER网络传播的中继。

通过光学显微镜识别叶片域

然后研究人员从功能角度检查了星形胶质细胞-突触界面。鉴于主干中的线粒体已被确定为星形胶质细胞钙微域的来源，研究人员想知道含有钙信号能力ER但不含线粒体的叶片是否代表更靠近突触的额外钙微域。为了定义这一点，他们使用了三维时间分辨双光子钙成像方法和条件性表达绿色荧光钙指示剂GCaMP6f的转基因品系GFAP^CreERT2Lck-GCaMP6f^f/f，在他莫昔芬(TAM)注射后选择性在星形胶质细胞中表达。

他们采用"负染色"方法，用星形胶质细胞选择性荧光线粒体标记病毒突出显示整个星形胶质细胞中的线粒体位置，并搜索与电子显微镜中观察到的口袋大小相似(6-7微米直径)的相邻非荧光区域。他们在星形胶质细胞周边识别了几个这样的区域，与线粒体阳性区域交错。然后他们通过局部共注射荧光报告蛋白突触后密度-95(PSD-95)与星形胶质细胞线粒体标记，研究这些立方体体积是否包含兴奋性突触。在线粒体包围的立方体中观察到圆形PSD荧光斑点簇。

为了确认PSD95阳性/线粒体阴性区域包含星形胶质细胞叶片，他们在TAM处理的GFAP^CreERT2Lck-GCaMP6f^f/f小鼠中共注射了突出显示星形胶质细胞线粒体和兴奋性突触后突触的病毒。在这种情况下，除了PSD95荧光斑点外，他们还观察到立方体无线粒体空间中的局部钙动力学。鉴于lck-GCaMP6f的星形胶质细胞特异性表达，这些钙事件必须发生在星形胶质细胞内，在无线粒体区域，这些区域含有兴奋性突触。总体而言，上述数据为在双光子显微镜下识别真正的星形胶质细胞叶片域和研究其钙动力学提供了基础。

叶片域中的钙信号

研究人员在成年GFAP^CreERT2Lck-GCaMP6f小鼠的DGML星形胶质细胞中进行了局部三维时间分辨双光子钙成像，这些小鼠表达荧光线粒体标记。病毒注射后3-4周，他们选择双荧光星形胶质细胞，并在其树枝状结构的周边定义立方体感兴趣体积(VOIs,12 x 9 x 10立方微米,x,y,z)。每个立方体包含线粒体阳性、荧光和无线粒体、非荧光区域。

他们进行了2分钟长、快速(~8赫兹)成像采集，之后他们使用线粒体荧光信号将VOI细分为两个三维区域：一个被线粒体占据("线粒体")，一个没有它们，推定性包含叶片和相关神经元结构("叶片")。因此，他们可以将钙信号归属于一个或另一个区域并进行分析。

只有18%的内源性三维钙活性(n=501个在26次采集中识别的事件)完全包含在VOI中，可以详细分析。其余82%仅部分包含：其中26%(n=105个事件)，起源于VOI内部但随后移动到外部，可以分析事件的起源区域。其余66%(n=269个)，从外部进入VOI的活动，和8%(n=36个)，采集不完全捕获的活动，无法有意义地分析。

关于完全包含在VOI中的钙事件，他们根据其起源分组为(1)在非荧光区域内扩展的事件("叶片"钙事件；25%,n=23)，(2)在荧光区域内扩展的事件("线粒体"钙事件；46%,n=42)，和(3)占据两个区域部分的事件(29%,n=26)。后者似乎不从一個区域移动到另一个，而是驻留在它们的界面，在一个由于有限的双光子分辨率难以分配的"灰色区域"。

"叶片"和"线粒体"中的事件在主要特征(三维体积或持续时间)上没有显著差异，但在这些条件下"线粒体"中的事件更频繁发生。尽管如此，~30%的在VOI内出生的196个钙事件明确起源于"叶片"内(n=58)，而那些没有退出VOI的事件仍然清晰地隔离在"叶片"区域内，与先前描述的线粒体钙微域不对应。它们相当异质，包括小的、短的和非常局部的事件以及更大和更持久的事件。

识别叶片域中的钙源：IP₃R1的作用

鉴于叶片中存在表达IP₃R的i-ER囊泡，研究人员接下来研究了"叶片"中的钙活性是否是IP₃R依赖性的。首先，他们使用他们最近的单细胞RNA patch-seq数据库检查了哪些IP₃R亚型在DGML星形胶质细胞中表达。他们发现94%的取样DGML星形胶质细胞(n=65)表达ltpr1转录本(编码IP₃R1)，65%表达ltpr2(IP₃R2)，只有1.5%表达ltpr3(IP₃R3)。几个星形胶质细胞同时包含ltpr1和ltpr2，它们各自的水平因星形胶质细胞而异。

知道IP₃R2删除消除了大部分Gq-GPCR激发的星形胶质细胞钙升高，他们然后评估了来自IP₃R2敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的DGML星形胶质细胞小立方体体积中的钙动力学。尽管在IP₃R2KO中有小的减少趋势，但总体而言，"叶片"和"线粒体"中钙事件的频率、体积和持续时间在KO和WT星形胶质细胞之间没有显著差异。

鉴于几份报告称星形胶质细胞钙活性包含IP₃R2KO不敏感成分，并且这些可能涉及IP₃R1和/或IP₃R3，研究人员决定使用表达lck-GCaMP6f和围绕每个三个ltpr基因(ltpr1,2,3^f/f小鼠)编码区域的floxed序列的转基因品系，从而能够在Cre重组后同时删除它们。为了触发星形胶质细胞特异性重组，他们在ltpr1,2,3小鼠的DG中注射了表达iCre和荧光报告蛋白 under 星形胶质细胞启动子的病毒构建体，这些小鼠也注射了星形胶质细胞靶向线粒体报告蛋白。

注射后5-8周，他们对双荧光DGML星形胶质细胞进行全细胞膜片钳，并对它们的个体核提取物进行基因组PCR。在7/8提取物中，所有三个ltpr floxed序列都被删除，在1/8中，其中两个被删除。相比之下，在来自相同小鼠的2/2全脑提取物中，他们观察到弱的删除条带，与仅发生在病毒注射的DGML星形胶质细胞小群体中的删除一致。

接下来，他们研究了删除所有IP₃Rs对星形胶质细胞钙动力学的影响。最初，他们看了整个星形胶质细胞尺度。他们在ltpr1,2,3^f/f小鼠的DG中双侧注射了星形胶质细胞靶向病毒构建体表达胞浆-GCaMP6f， together with，在一个半球中，表达iCre的病毒与荧光报告蛋白以诱导星形胶质细胞选择性IP₃R删除(IP₃R1,2,3^GFAP-KO)，在另一个半球中，仅表达报告蛋白的对照病毒。他们对两个半球的双荧光星形胶质细胞进行三维时间分辨双光子钙成像，选择大VOIs(50 x 50 x 30立方微米,x,y,z)以可视化大多数星形胶质细胞结构中的动力学。

图表显示IP₃-R1,2,3^GFAP-KO星形胶质细胞中钙事件频率急剧下降，降至对照的<10%，伴随着钙活性占据的累积体积和少数残留事件持续时间的类似下降。因此，在他们的条件下，IP₃Rs是内源性星形胶质细胞钙动力学的主要来源。此外，IP₃-R1,2,3^GFAP-KO抑制了所有类型的星形胶质细胞钙事件，包括星形胶质细胞周边的小事件，表明不同于IP₃R2的IP₃Rs维持那些区域的钙动力学。

为了验证这个想法，他们在小周边VOIs中成像钙动力学，比较WT和IP₃R1,2,3^GFAP-KO星形胶质细胞的结果。他们在WT和ltpr1,2,3^f1/f小鼠的DG中注射了三种星形胶质细胞靶向病毒的鸡尾酒以(1)表达lck-GCaMP6f，(2)可视化线粒体，和(3)在ltpr1,2,3^f/f小鼠的星形胶质细胞中触发iCre重组，或其在WT中的假效应。他们对三荧光DGML星形胶质细胞进行三维时间分辨钙成像。

在WT星形胶质细胞的17个VOIs中，钙活性类似于先前在GFAP^CreERT2Lck-GCaMP6f小鼠中看到的活性(平均频率:110±20对126±25毫赫兹)。该活性的14%由完全包含在VOI中的钙事件组成，其中38%起源于"叶片"，56%起源于"线粒体"，6%在它们的界面。相比之下，在IP₃R1,2,3^GFAP-KO星形胶质细胞(n=12 VOIs)中，他们几乎看不到"叶片"中的任何钙活性，与WT相比事件频率下降85%。重要的是，在相同的VOIs中，邻近"线粒体"中的钙事件与WT星形胶质细胞一样频繁发生，尽管持续时间增加。他们排除了"叶片"中钙活性的选择性丢失是由于他们立方体中"叶片"/"线粒体"体积比的减少(WT对IP₃R1,2,3^GFAP-KO:p=0.92,n=27;Wilcoxon秩和检验)。因此，星形胶质细胞"叶片"中的钙活性(但不在"线粒体"中)是IP₃R依赖性的并且需要IP₃R1，考虑到DGML星形胶质细胞中缺乏IP₃R3。这些数据进一步将叶片识别为具有与主干不同的结构功能特性的特化区室。

叶片域中的钙活性取决于神经元活动

研究人员接下来研究了DGML星形胶质细胞"叶片"中的钙动力学是否由来自穿通通路-颗粒细胞(PP-GC)兴奋性回路的嵌入突触的内源性活动诱导。为了阻断动作电位激发和自发的PP-GC活性，他们使用了药理学鸡尾酒，包括河豚毒素(TTX)和电压门控钙通道(VGCC)拮抗剂溶解在人工脑脊液(ACSF)中。确实，该鸡尾酒强烈降低了所有PP-GC突触事件的频率，并且比单独TTX更有效(ACSF+TTX+VGCC拮抗剂对ACSF+TTX:p<0.0001，双尾配对t检验)。

为了评估鸡尾酒对局部钙动力学的影响，他们在来自GFAP^CreERT2Lck-GCaMP6f小鼠的切片中成像了双荧光DGML星形胶质细胞小立方体VOIs中的钙动力学。在对照条件(标准ACSF浴)下，局部钙活性类似于先前实验中看到的活性(平均频率:126±26毫赫兹,n=13 VOIs)。该活性的21%完全限制在VOI中，其中22%起源于"叶片"，51%起源于"线粒体"，27%在它们的界面。 upon 应用突触阻断剂鸡尾酒(n=12 VOIs)，"叶片"中的钙活性急剧下降(-95%频率)，而在"线粒体"中没有变化。界面处的活性被阻断剂 dramatically 抑制(-83%)，类似于"叶片"中的活性，表明共同起源。

为了直接显示"叶片"中的钙动力学取决于邻近神经元中的活性，他们建立了轴突和星形胶质细胞中的双色局部钙成像。他们在GFAP^CreERT2Lck-GCaMP6f小鼠中注射了神经元靶向病毒构建体表达红色钙指示剂RCaMP3，在II-III层内侧内嗅皮层(MEC)兴奋性神经元中，其PP轴突与齿状GCs形成突触，并 parallel，在DG中注射了星形胶质细胞靶向线粒体报告蛋白。

他们在相对大的二维视场(FOVs)上以非常快的速度(60赫兹)进行钙成像，同时刺激PP轴突。为了识别协调的个体轴突-星形胶质细胞动力学的位点，他们产生了他们采集的时间平均钙图，揭示了星形胶质细胞和轴突都活跃的FOV位置。通过将这些图与星形胶质细胞线粒体图叠加，他们定义了星形胶质细胞的"叶片"和"线粒体"区域，并最终可以定位三个连续感兴趣区域(ROIs)以分别研究局部"叶片"、"线粒体"和"轴突"钙动力学。

左面板显示了一个例子，其中"Axon" ROI中的重复局部钙升高由三个时间间隔的电刺激激发。在这些刺激中的两个期间，"Axon"响应迅速 followed by "叶片" ROI中的钙升高，但不在"线粒体" ROI中，尽管"线粒体"和"叶片" ROIs与活跃"Axon" ROI等距。右面板显示了相同的实验，但这次在TTX+VGCC阻断剂存在下。在这种情况下，"Axon"和邻近"叶片" ROIs对所有电刺激保持沉默，而独立钙事件发生在"线粒体" ROI中。他们得出结论，"叶片"中的钙活性但不在附近"线粒体"中由神经元活动触发，并且叶片是用于突触信号整合的选择性星形胶质细胞域。

叶片中的钙事件反映了邻近神经元活动的整合

他们接下来分析了在对照条件下观察到的所有"叶片"中钙事件的时空特征(n=53)。事件分为两组：30%是"单起源"的，即它们在给定时间点起源于单个位置，而70%是"多起源"的，即它们显示两个或更多具有不同空间和/或时间起源的初始钙升高，后来合并在一起。对于23/37多起源事件，他们可以额外量化：(1) distinct 起源的类型：57%是空间上 distinct，4%时间上 distinct，和39%空间和时间上都 distinct，和(2) distinct