电穿孔技术对细胞外囊泡（EVs）特性的影响及其在药物递送系统（DDS）中的应用挑战

本综述系统评估了电穿孔（Electroporation）技术对细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）基本特性的影响，重点探讨了电穿孔缓冲液（EB）及参数（电压、脉冲数、脉冲宽度）对EVs粒径、浓度、分散性（PDI）、Zeta电位（ZP）及表面蛋白的调控作用。研究强调现有电穿孔方案源于细胞转染，未针对EVs优化，可能导致EVs聚集、膜蛋白损伤及表面电荷中性化，进而影响其作为药物递送系统（DDS）的生物分布和疗效。建议未来研究优化电穿孔缓冲液成分及参数以维持EVs天然特性。

　　

细胞外囊泡（EVs）是由原核和真核细胞分泌的异质性膜包被纳米颗粒，最初被视为细胞废物排出载体，现被证实可在细胞间传递蛋白质、脂质和核酸等生物活性物质，并因其稳定性、靶向性、低免疫原性及表达CD47等“别吃我”信号而成为极具潜力的天然药物递送系统（DDS）。EVs能够跨越血脑屏障等生物屏障，在治疗应用中展示出优于脂质体等合成DDS的独特优势。

电穿孔作为EVs负载治疗性分子（如siRNA、小分子药物）的常用主动加载策略，通过短暂电刺激在脂质双分子层形成可逆孔道，促进亲水性小分子进入囊泡腔。然而，该技术参数（电压、脉冲数、脉冲宽度）在不同研究中存在高度 variability，且其优化主要基于细胞转染体系，缺乏对EVs特异性的考量。电穿孔可能引发EVs膜结构损伤、热效应及不可逆变化，进而影响其治疗效用。

本研究以C2C12小鼠成肌细胞来源的EVs为模型，通过超速离心（UC）分离EVs，并利用Neon?转染系统在不同电压（500–1000 mV）、脉冲数（1–3）和脉冲宽度（10–30 ms）下进行电穿孔处理。通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）、Zeta电位测定、BCA蛋白定量及Western blot等技术，系统评估了电穿孔缓冲液（EB）及电穿孔参数对EVs特性的影响。

研究首先发现，将EVs悬浮于电穿孔缓冲液（EB）中即导致颗粒浓度显著降低（从7.27×10⁷ particles/mL降至1.59×10⁷ particles/mL），流体动力学尺寸增大（NTA模式尺寸从166.30 nm增至258.70 nm），Zeta电位（ZP）负电性减弱（从-14.10 mV变为-10.14 mV），表面蛋白浓度下降（从2879 μg/mL降至2095 μg/mL）。这些变化提示EB本身可能诱导EVs聚集或融合。

通过DPBS洗涤尝试恢复EVs天然特性，但未成功。洗涤后EB组EVs尺寸进一步增大至425.70 nm，多分散指数（PDI）从0.32升至0.82，ZP负电性继续减弱（-9.56 mV）。表明EB引起的改变具有不可逆性，可能源于缓冲液中离子、盐类和糖类成分对EVs膜稳定性的影响。

在电穿孔参数影响方面，电压应用（500 V、750 V、1000 V）未引起颗粒尺寸显著变化，但500 V显著降低了PDI，1000 V使ZP负电性大幅降低（68.79% reduction）。脉冲数增加（1脉冲和3脉冲）导致ZP更趋中性化；脉冲宽度（20 ms和30 ms）显著降低PDI，同时所有脉冲宽度均引起ZP负电性减弱。这些参数均未显著改变颗粒尺寸，但进一步降低了表面蛋白浓度（如500 V、750 V、1000 V及10 ms、20 ms脉冲宽度均引起显著下降）。

Western blot分析显示，EB悬浮导致EV标志物Annexin A2和CD9表达明显减少，但电穿孔参数应用未引起额外显著变化。负标志物calnexin未检测到，表明样品中无细胞杂质污染。

讨论部分指出，电穿孔诱导的EVs特性改变可能影响其作为DDS的核心功能。尺寸增大会改变生物分布并激活免疫清除，表面电荷中性化可能影响蛋白 corona 形成、体内半衰期及细胞摄取效率。现有电穿孔缓冲液（如Neon?转染缓冲液）的成分可能不适用于EVs，需针对EVs特性优化缓冲液配方（如调整盐浓度、添加海藻糖等保护剂）。此外，超速离心等分离方法可能加剧EVs聚集，未来或需开发更温和的分离策略。

结论强调，电穿孔作为EVs负载的常用技术，其方案需进一步优化以最小化对EVs天然特性的干扰。未来研究应探索不同细胞来源（如MSCs、HEK293T、RAW264.7或乳汁EVs）对电穿孔的响应差异，并评估这些特性改变在生物系统中的实际翻译影响。