基于HPLC-MS/MS技术的I-BET151大鼠血浆药代动力学研究及方法学验证

本文建立并验证了一种灵敏、特异的HPLC-MS/MS方法，用于定量大鼠血浆中BET抑制剂I-BET151的浓度。该方法采用液相色谱-质谱联用技术，通过优化色谱条件（Poroshell 120 EC-C18色谱柱，梯度洗脱）和质谱参数（ESI正离子模式，MRM监测），结合液液萃取前处理，实现了I-BET151的准确测定。方法学验证表明，该方法线性范围良好（20–10000 ng/mL），精密度、准确度、回收率和稳定性均符合生物样品分析要求。药代动力学研究显示，I-BET151口服生物利用度高达60%，半衰期约4小时，展现出良好的成药性前景。

　　

Abstract

Propose

溴结构域和超末端结构域抑制剂（I-BET151）在治疗慢性移植物抗宿主病方面具有显著疗效，近年来受到广泛研究。然而，关于I-BET151的药代动力学研究较为有限，尤其缺乏体内浓度测定的方法。因此，本研究旨在建立一种HPLC-MS/MS方法，用于测定大鼠血浆中I-BET151的浓度，并应用于其药代动力学研究。

Methods

色谱柱为Poroshell 120EC-C₁₈柱（50 mm × 4.6 mm, 2.7 μm），流动相为含20 mmol乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液与含0.1%甲酸的甲醇溶液，流速为0.6 mL/min。I-BET151的提取采用液液萃取法，萃取溶剂为乙醚:二氯甲烷=2:3。该方法根据《中国药典》生物样品定量方法指导原则进行了验证，包括特异性、标准曲线、定量下限、残留效应、精密度、回收率、基质效应和稳定性等。

Results

结果表明，所建立的方法符合方法学验证标准，可用于I-BET151的药代动力学研究。药代动力学结果显示，口服和静脉注射I-BET151的半衰期分别为4.3 h和3.1 h，口服生物利用度约为60%，表明I-BET151具有较高的口服生物利用度和适当的半衰期，展现出良好的临床应用前景。

Introduction

异基因造血干细胞移植是治疗多种血液疾病的重要手段，但其并发症尤其是慢性移植物抗宿主病的发生引起了广泛关注。慢性移植物抗宿主病的发病机制复杂，涉及免疫细胞对受体组织的攻击、细胞因子释放及组织纤维化等过程。目前临床一线治疗主要采用糖皮质激素和钙调神经磷酸酶抑制剂，但约半数患者对一线治疗不敏感，且长期使用激素可能导致感染、高血压、骨质疏松等副作用。因此，开发新的治疗方法至关重要。

溴结构域和超末端结构域（BET）是一类能够识别乙酰化赖氨酸残基的蛋白质结构域，在细胞周期调控和基因转录中发挥重要作用。BET家族包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT四个成员，与肥胖、肺纤维化、肿瘤、心力衰竭及慢性移植物抗宿主病等多种疾病的发生发展密切相关。I-BET151是一种新型小分子BET抑制剂，对BRD2、BRD3和BRD4具有高亲和力，通过作用于COX-2、P450、GSK3β、PI3K等多种蛋白发挥药理作用，对多种肿瘤的恶性表型具有抑制作用。研究表明，I-BET151能够显著抑制树突状细胞和T细胞功能，在异基因造血干细胞移植小鼠模型中早期短期给药可显著降低慢性移植物抗宿主病的严重程度。

尽管对I-BET151的作用机制、疗效和潜在毒性已有较深入研究，但其体内药代动力学行为缺乏相关数据和报道，直接影响后续制剂开发、药物相互作用研究及给药方案制定。HPLC-MS/MS技术因其高特异性、高灵敏度、高通量及能够同时检测多种药物和代谢产物的优势，成为小分子药物体内分析的金标准。本研究旨在建立一种快速、灵敏的HPLC-MS/MS方法，用于测定大鼠血浆中I-BET151的浓度，并进行系统的方法学验证，最终应用于大鼠药代动力学研究，为I-BET151的进一步研究提供理论支持。

Methods

Experimental Reagents

I-BET151（纯度99.5%）和地西泮（内标，IS，纯度99.9%）分别购自Selleck & bimake（美国德克萨斯）和Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。甲醇和乙腈购自Fisher Scientific（美国匹兹堡），水由Millipore Milli-Q纯水系统制备。甲酸和乙酸铵购自Sigma-Aldrich。所有溶剂和化学品均为HPLC级，使用前无需进一步纯化。

Equipment and Conditions

采用Jasper? HPLC系统（日本岛津），包括SCIEX Dx Pump（x2）、SCIEX Dx Sampler、SCIEX Dx Oven、SCIEX Dx Controller和SCIEX Dx Degasser。色谱分离使用Poroshell 120 EC-C₁₈柱（50 mm × 4.6 mm, 2.7 μm），柱温35°C。流动相A为含20 mmol乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱条件见表1。质谱检测采用AB SCIEX Triple Quad 4500MD系统，配备电喷雾离子化（ESI）源，正离子模式监测。I-BET151和地西泮的MRM过渡离子对分别为m/z 416.0/311.1和m/z 285.1/193.0，主要质谱参数见表2。其他优化参数包括：离子源温度（TEM）500°C，入口电位（EP）25，帘气（CUR）45，Turbo Gas 2（GS2）40，Turbo Gas 1（GS1）40。数据采集使用Analyst软件1.6.2。

Stock Solutions, Quality Control Samples and Calibration Standards

精确称取2 mg I-BET151对照品，用甲醇溶解并定容至10 mL，制备200.0 μg/mL储备液。精确称取1.00 mg地西泮对照品，用甲醇溶解并定容至10 mL，制备100.0 μg/mL储备液。将I-BET151储备液用甲醇逐步稀释，得到0.2、0.5、2.0、5.0、20.0、50.0和100.0 μg/mL系列标准溶液；地西泮储备液稀释得到200 ng/mL溶液。取100.0 μL大鼠空白血浆，分别加入10.0 μL I-BET151系列标准溶液和10.0 μL 200 ng/mL地西泮溶液，制备I-BET151浓度为20.0、50.0、200.0、500.0、2000.0、5000.0和10000.0 ng/mL的血浆样品。按“血浆样品处理方法”处理，进样2.0 μL分析，记录色谱图。以I-BET151与地西泮的峰面积比为纵坐标，I-BET151浓度为横坐标，采用最小二乘法拟合标准曲线。质控（QC）样品包括高浓度QC（8000.0 ng/mL）、中浓度QC（500.0 ng/mL）、低浓度QC（40.0 ng/mL）和定量下限（LLOQ，20.0 ng/mL），用于方法稳定性评价。

Plasma Sample Processing Method

取100.0 μL血浆样品置于7.0 mL塑料圆底EP管中，加入10.0 μL地西泮溶液和3 mL混合萃取溶剂（乙醚:二氯甲烷=2:3），涡旋6 min，3000 rpm离心8 min。取上清液转移至10 mL尖底EP管中，40°C氮气流下吹干。残留物用300 μL甲醇复溶，涡旋6 min，15000 rpm离心8 min，取上清液进行进样分析。

Method Validation

方法验证依据《中国药典》生物样品定量方法指导原则进行。

Specificity

取6只大鼠混合空白血浆100.0 μL，不加内标，按“血浆样品处理方法”操作，进样3.0 μL，记录色谱图。在空白大鼠血浆中加入适量I-BET151溶液制备模拟血浆样品，同法处理并进样分析。取给药后大鼠血浆样品，同法处理并进样分析。要求干扰组分响应低于I-BET151定量下限响应的20%且低于地西泮响应的5%。

Linearity, LLOQ and Carryover

线性范围设为20.0–10000.0 ng/mL。要求标准曲线各浓度点计算浓度与标示浓度偏差在±15%以内，LLOQ偏差在±20%以内。LLOQ为可靠定量的最低浓度点。进样最高浓度样品后进样空白血浆样品考察残留效应，要求空白样品中残留不超过LLOQ的20%且不超过地西泮的5%。

Accuracy and Precision

取空白血浆100.0 μL，按“标准曲线制备”方法制备低、中、高浓度（40.0、500.0、8000.0 ng/mL）QC样品，每个浓度6样本，连续测定3天。根据标准曲线计算QC样品浓度，计算精密度（RSD）和准确度（RE），要求RSD和RE均低于15.0%。

Extraction Recovery and Matrix Effect

取空白血浆100.0 μL，同法制备低、中、高浓度QC样品，按“血浆样品处理方法”处理，得峰面积A。另取空白血浆100.0 μL，加3 mL萃取溶剂，涡旋6.0 min，3000.0 rpm离心8.0 min，取上清液加入10.0 μL I-BET151溶液和10.0 μL地西泮溶液，同法处理，得峰面积B。提取回收率按A/B计算。取空白血浆100.0 μL，加3 mL萃取溶剂，同法处理得上清液，加入10.0 μL I-BET151溶液和10.0 μL地西泮溶液，同法处理得峰面积A；取水100.0 μL，同法处理得上清液，加入同量药物溶液，同法处理得峰面积B。基质效应按A/B计算。

Stability

考察QC样品在室温12 h（短期）、-20°C 30 d（长期）、-20°C至室温3次循环（冻融）及4°C 24 h（自动进样器）条件下的稳定性，RE应小于15%。

Dilution Integrity

制备40000.0 ng/mL血浆样品，用空白血浆稀释至500.0 ng/mL和8000.0 ng/mL，每个浓度3样本，按“血浆样品处理方法”处理。要求检测浓度与理论浓度RE%小于15.0%。

Application

Animal Experimental Protocol

雄性SD大鼠（约200 g）随机分为2组，每组10只。实验前禁食12 h，自由饮水。所有动物实验操作符合中国科学技术委员会颁布的动物实验管理规定，并经中国医科大学肿瘤医院医学伦理委员会批准（伦理号KT20240319）。第一组灌胃给予I-BET151混悬液（20 mg/kg），第二组尾静脉注射I-BET151溶液（20 mg/kg）。于给药后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24和48 h采集眼眶血约0.3 mL，肝素化毛细玻璃管收集，离心分离血浆，按“血浆样品处理方法”处理和分析。

Processing and Analysis of Pharmacokinetic Parameters

采用DAS 3.0软件处理数据，计算药代动力学参数包括最大血药浓度（C_max）、达峰时间（T_max）、0–48 h血药浓度-时间曲线下面积（AUC_0→t）、消除半衰期（t_1/2）、0–∞时间曲线下面积（AUC_0→∞）、清除率（CL）和表观分布容积（V_d）。

Results and Discussion

Method Optimization

通过系统优化，确定色谱柱为Poroshell 120 EC-C₁₈柱，流动相为含20 mmol乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的甲醇溶液，柱温35°C，梯度洗脱（表1）。在此条件下，I-BET151和地西泮的保留时间分别为2.03 min和2.34 min。质谱参数优化后采用ESI正离子模式，MRM离子对为m/z 416.0/311.1（I-BET151）和m/z 285.1/193.0（地西泮），参数见表2。其他参数为CUR:40，TEM:500，GS1:40，GS2:50，CAD:Medium，IS:5500，EP:18，CXP:10。比较不同萃取溶剂（乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及混合溶剂）的回收率，最终确定乙醚:二氯甲烷=2:3为最佳萃取溶剂，I-BET151和地西泮回收率高且稳定。

Method Validation

Specificity

结果表明血浆中内源性物质不干扰I-BET151和地西泮的测定，液液萃取可有效去除基质干扰。典型色谱图见图3。

Linearity and LLOQ

I-BET151在20.0–10000.0 ng/mL范围内线性良好，典型标准曲线方程为y=0.4793x+1.1085（r=0.9998）。LLOQ为20.0 ng/mL。

Precision and Accuracy

结果见表3。I-BET151的日内精密度、日间精密度和准确度均小于15.0%，符合方法学验证要求，表明方法可靠，能保证体内药物测定结果的准确性。

Recovery and Matrix Effect

结果见表3。I-BET151和地西泮的提取回收率分别为93.7–103.6%和96.2–99.2%，基质效应为86.5–112.4%，符合要求。表明所建立的方法和药物提取方法适当，大鼠血浆中磷脂和蛋白质等基质不干扰分析物和内标的离子化及准确测定。

Stability

结果见表4。血浆样品的冻融稳定性、自动进样器稳定性和长期稳定性均符合要求，表明I-BET151和地西泮稳定性良好。

Dilution Integrity

结果见表4。所有稀释试验中检测浓度与理论浓度的RE%均小于15.0%，表明稀释不影响方法的准确测定。

Application

按“血浆样品处理方法”处理样品，应用所建立的HPLC-MS/MS方法测定血浆浓度，计算药代动力学参数。结果见表5和图4。

由图4和表5可知，灌胃给予I-BET151的生物利用度较高，约为尾静脉给药的60%。大鼠个体间无显著差异。灌胃给药因涉及吸收过程，其峰浓度较低、达峰时间较长。两组间清除率和半衰期无显著差异。口服给药的血药浓度-时间曲线呈现明显的吸收相、分布相和消除相，符合二室模型特征。综上所述，研究结果揭示了I-BET151在大鼠体内的行为特征，有助于I-BET151相关制剂的开发及进一步药理学研究。

Conclusion

本文建立并验证了一种快速、特异的HPLC-MS/MS方法，用于测定大鼠血浆中I-BET151的浓度，并成功应用于SD大鼠的药代动力学研究。药代动力学结果表明，I-BET151口服生物利用度良好，可达静脉给药的60%，且表现出规律的药代动力学行为和适当的半衰期。研究结果为进一步研究I-BET151的剂量-效应关系和作用机制提供了参考。

Disclosure

作者声明无利益冲突。作者独自负责本文的内容和撰写。