艾塞那肽-4刺激内皮细胞分泌外泌体miR-450b-5p保护视网膜神经节细胞抵抗缺血再灌注损伤的机制研究

本研究揭示了GLP-1R激动剂Exendin-4（Ex-4）通过激活血管内皮细胞（VECs）的GLP-1R，促进其分泌富含miR-450b-5p的细胞外囊泡（EVs），经外泌体途径将miR-450b-5p递送至视网膜神经节细胞（RGCs），通过靶向抑制ACSL4表达，显著减轻缺血再灌注（RIR）导致的氧化应激和细胞死亡，为缺血性眼病提供了新的神经血管单元保护策略。

　　

背景

视网膜缺血再灌注（RIR）损伤是多种眼部缺血性疾病的关键病理机制，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性丧失。艾塞那肽-4（Ex-4）作为一种广泛使用的胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激动剂，已被报道对多个重要器官的缺血再灌注（IR）损伤具有保护作用，但其在RIR损伤中的潜在神经保护作用尚不清楚。

方法

研究采用免疫荧光染色和苏木精-伊红（HE）染色评估Ex-4的神经保护作用。建立了人视网膜血管内皮细胞（HRVECs）与RGCs的共培养体系。在氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）条件下，从经Ex-4处理（E-EVs）或未处理（O-EVs）的HRVECs培养上清液中分离细胞外囊泡（EVs）。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和纳米流式细胞术（NanoFCM）检测EVs的存在和纯度。评估了RGCs的细胞活性、活性氧（ROS）水平和细胞死亡率。对E-EVs和O-EVs进行全局miRNA测序以探索潜在机制。

结果

研究发现Ex-4通过GLP-1R依赖性途径对RGCs发挥神经保护作用。血管内皮细胞（VECs）来源的EVs介导了Ex-4在急性RIR损伤中对RGCs的保护作用。研究鉴定出miR-450b-5p是E-EVs中高度富集的miRNA。使用E-EVs或miR-450b-5p模拟物处理均能显著保护RGCs免受RIR诱导的损伤。机制研究表明，酰基辅酶A（CoA）合成酶长链家族成员4（ACSL4）是miR-450b-5p的直接作用靶点。

结论

Ex-4通过刺激视网膜VECs分泌富含miR-450b-5p的EVs，在RIR损伤中发挥其神经保护作用，从而揭示了一条新的内皮细胞介导的缺血性疾病神经保护通路。

详细研究发现

Ex-4通过GLP-1R依赖性途径保护RGCs免受RIR损伤

RGCs的丢失被认为是RIR损伤后神经退行性变的标志。为了初步评估Ex-4的神经保护潜力，在RIR诱导后24小时通过玻璃体内注射给予Ex-4（1 μg/μl）。诱导后七天，使用H&E染色评估视网膜组织学变化。RIR损伤导致视网膜内层显著变薄，尤其是神经节细胞层和内丛状层（GCL+IPL）的厚度。与RIR组相比，Ex-4处理减轻了RIR诱导的视网膜内层结构损伤。通过光学相干断层扫描（OCT）分析获得了一致的结果，证实了组织学观察到的神经保护作用。选择性表达于GCL细胞的Brn3a，是检测RGC存活显著变化的可靠标志物。视网膜全片的Brn3a免疫染色显示，Ex-4处理显著减轻了RIR诱导的RGC死亡。这些结果共同表明，Ex-4处理有效减轻了RIR诱导的视网膜内层结构损伤并防止了RGCs的丢失，证实了其针对RIR损伤的神经保护作用。

为了进一步评估Ex-4是否通过结合GLP-1R发挥其神经保护作用，将GLP-1R拮抗剂Exendin-9-39（Ex-9-39, 4 μg/μl）与Ex-4共同玻璃体内注射。结果表明，通过Ex-9-39药理阻断GLP-1R逆转了Ex-4对RIR诱导损伤的神经保护作用，证实了GLP-1R激活的关键必要性。

Ex-4在OGD/R损伤下对RGCs无直接保护作用

采用免疫荧光法评估GLP-1R是否存在于小鼠RGCs中。RBPMS是敏感且特异性检测RGC的成熟标志物。研究发现，在体内，GLP-1R未与RGCs的RBPMS共表达。采用OGD/R模型，因其是研究RIR损伤的成熟体外系统。研究进一步探讨了Ex-4在OGD/R损伤下是否对RGCs发挥直接保护作用。经过4小时缺血和24小时再灌注后，RGCs的相对活力降至约50%，ROS水平增加了1.4倍，RGCs的死亡率增加了3.4倍。经Ex-4（10 nM）处理后，在降低的细胞活性、增加的ROS水平或细胞死亡率方面未观察到显著改善，表明Ex-4在OGD/R损伤下对RGCs无直接保护作用。

VECs-EVs介导Ex-4在OGD/R损伤下对RGCs的保护作用

研究假设VECs可能介导Ex-4对RGCs的保护作用。建立了HRVECs和RGCs的共培养系统，发现用Ex-4处理（24小时）的HRVECs与RGCs共培养可显著改善OGD/R诱导的RGCs损伤，表现为细胞活力增加、ROS水平降低和神经元死亡率降低。

越来越多的证据表明，VECs分泌的细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中起着关键作用。GW4869，一种中性鞘磷脂酶抑制剂，被用作特异性阻断EVs分泌的抑制剂。为了研究EVs是否介导经Ex-4处理的VECs（Ex-4/VECs）对RGCs的神经保护作用，建立了有或无GW4869的Ex-4/VECs与RGCs在OGD/R损伤下的共培养系统。结果表明，添加GW4869部分消除了Ex-4/VECs的神经保护作用。

为了进一步研究Ex-4/VECs的直接神经保护作用，随后从OGD/R损伤下的HRVECs培养上清液中分离了EVs，分为经Ex-4处理（E-EVs）和未经Ex-4处理（O-EVs）两组。NTA显示EVs的直径分布范围在30-120 nm之间。NanoFCM检测到EVs表面的阳性标志物CD9和CD81。TEM显示分离的EVs具有典型的碟状形状和双层膜结构。然后用PKH67标记VECs来源的EVs，并将原代RGCs与PKH67标记的EVs一起孵育。发现RGCs有效地吸收了PKH67标记的EVs，主要位于细胞体。

来自Ex-4/VECs的EVs保护RGCs免受RIR损伤

为了评估E-EVs在体内RIR损伤下的神经保护作用，在再灌注后24小时通过玻璃体内注射给予EVs（1×10⁷颗粒/μL）。结果显示，与RIR+O-EVs组相比，E-EVs给药部分恢复了视网膜内层结构损伤。视网膜全片的RBPMS免疫染色显示，E-EV处理挽救了RGC死亡，与RIR+O-EVs组相比增加了20%。研究进一步在体外OGD/R条件下的原代RGCs中扩展了观察。在OGD处理后，将RGCs与E-EVs或O-EVs孵育24小时。PI/Calcein-AM染色 assay 显示，与E-EVs孵育降低了RGCs的死亡率。此外，发现与E-EVs孵育的OGD/R处理的RGCs活力增加，ROS水平降低。

VECs-EVs含有miR-450b-5p介导Ex-4在OGD/R损伤下对RGCs的保护作用

研究采用Agilent miRNA微阵列分析系统性地鉴定可能负责E-EVs诱导的针对OGD/R损伤神经保护作用的候选miRNAs。共鉴定出1647个miRNAs，其中15个miRNAs在O-EVs和E-EVs之间差异表达。RT-PCR显示，与O-EVs相比，miR-450b-5p在E-EVs中高度富集。为了验证miR-450b-5p是否介导E-EVs的神经保护作用，用miR-450b-5p模拟物转染原代RGCs。与Cy3-miR-450b-5p孵育6小时后，超过80%的RGCs呈现阳性Cy3荧光。过表达miR-450b-5p对OGD/R损伤下的RGCs显示出与E-EVs相似的保护作用。结果显示，与NC处理组相比，miR-450b-5p模拟物处理提高了细胞活力，降低了ROS水平和RGCs的死亡率。这些发现表明，miR-450b-5p可以作为E-EV诱导的OGD/R损伤下RGCs保护作用的中介物。

外泌体miR-450b-5p通过靶向ACSL4减轻OGD/R损伤下的神经元损伤

来自最新研究的令人信服的证据表明，ACSL4是各种器官（特别是脑、心和肠）中IR损伤的关键介质。然而，ACSL4在RIR损伤中的参与尚未得到实验验证。使用RNAhybrid软件，观察到miR-450b-5p和ACSL4之间的结合自由能较低，表明存在稳定的结合倾向。为了研究OGD/R条件下RGCs中miR-450b-5p和ACSL4之间的相互作用，转染了miR-450b-5p模拟物并检测了ACSL4表达。结果显示，miR-450b-5p过表达抑制了ACSL4的表达。研究进一步阐明了E-EVs内容物miR-450b-5p调控作用的机制见解。与Ctr组相比，OGD/R损伤增加了Fe²⁺和ROS水平，而miR-450b-5p模拟物或si-ACSL4显著抵抗了OGD/R损伤下RGCs的神经元损伤，表现为Fe²⁺和ROS水平降低。总之，这些结果表明，从Ex-4刺激的VECs分泌的EVs通过miR-450b-5p/ACSL4通路保护RGCs免受RIR损伤。

讨论

IR损伤是广泛病理中的关键病理生理机制，包括心肌梗死、缺血性卒中、急性肾损伤、创伤和各种视网膜缺血性疾病。因此，识别挽救IR损伤的新功能靶点或药物至关重要。先前的研究证明了Ex-4在RIR损伤下的视网膜血管保护作用。然而，Ex-4在急性RIR或青光眼模型中是否具有神经保护作用尚未阐明。本研究注意到了Ex-4在RIR损伤下的神经保护作用。本研究阐述了一种新的旁分泌保护机制，即Ex-4通过调节VEC功能保护OGD/R条件下的RGCs，提示了一种神经血管单元介导的保护通路。

视网膜组织代谢极其旺盛，视觉神经元的血液供应主要来自终末分支的视网膜血管，这些血管严重受缺血影响。一旦发生视网膜缺血，会诱导RGCs进行性丢失并导致显著的视觉功能障碍。当前研究阐明Ex-4对多个重要器官的IR损伤具有神经保护作用。然而，Ex-4在急性RIR诱导的RGCs损伤中的神经保护作用及其潜在机制仍未完全了解。在本研究中，建立了小鼠急性RIR和OGD/R模型以研究Ex-4的神经保护作用。研究发现Ex-4处理显著减轻了急性RIR损伤后的视网膜内层结构损伤和RGCs丢失。同时，研究证明GLP-1R拮抗剂（Ex-9-39）有效 abolished Ex-4介导的神经保护作用，证实了GLP-1R激活在此过程中的 essential 作用。

当前研究证实GLP-1RAs的下游调控效应依赖于GLP-1R的存在。然而，GLP-1R在视网膜组织中的分布仍存在争议。与先前报道相反，最近的研究通过单细胞测序发现人RGCs中不存在GLP-1R。作为一种G蛋白偶联受体，GLP-1R通常在不同物种间表现出高度同源性。本研究中，证明了在原代小鼠RGCs中未检测到GLP-1R表达。这一发现从机制上解释了我们的 paradoxical 观察：虽然玻璃体内注射Ex-4在体内发挥神经保护作用，但由于缺乏GLP-1R表达，Ex-4处理对OGD/R诱导的RGC损伤没有显著改善。结合上述研究和本研究结果，我们推测Ex-4可能通过其他间接途径在RIR损伤下对RGCs发挥保护作用。

血管内皮细胞构成血管系统的基本结构和功能单元，可通过释放多种神经营养和血管生成因子（包括血管内皮生长因子、BDNF和神经生长因子）促进神经元存活和血管生成。考虑到血管和神经系统之间不可分割的解剖和功能相互作用，我们假设Ex-4通过VECs介导的途径发挥其神经保护作用。建立了HRVECs/RGCs共培养系统。研究结果表明，用Ex-4预处理的HRVECs在共培养系统中显著减轻了OGD/R诱导的RGCs损伤。这些结果阐述了一种新的旁分泌保护机制，即Ex-4通过调节VECs功能保护OGD/R条件下的RGCs，提示了一种神经血管单元介导的保护通路。

VECs来源的EVs是一种新认识的血管分泌信号形式，已被证明在多种人类疾病（如心血管疾病）中具有保护作用。鉴于ECs相对容易进行体外培养，VECs来源的EVs代表了治疗IR诱导的神经元损伤的有希望的候选者。数据表明原代RGCs可以内化来自内皮细胞分泌的EVs。然而，这一过程的动态监测以及EVs在RGCs中的精确细胞内定位仍有待进一步研究。越来越多的证据表明，在广泛的实验环境中，miRNAs是通过EVs进行细胞间信号传导的核心介质。为了研究哪种外泌体miRNA在急性RIR损伤下对RGCs赋予保护作用，收集了O-EVs和E-EVs进行miRNA测序分析。miR-450b-5p已在心、肾、肝和脑组织的缺血/再灌注损伤中得到研究。同时，血浆外泌体miR-450b-5p已被发现是大鼠短暂性脑缺血发作的潜在生物标志物和治疗靶点。本研究鉴定出miR-450b-5p是E-EVs诱导的急性RIR损伤下RGCs保护作用的关键介质。然而，我们并不完全排除其他差异表达miRNAs（如miR-191-5p, miR-30d-5p, miR-323a-3p, miR-11980 和 miR-3648）和其他EV成分（例如蛋白质、脂质）对此神经保护作用的贡献，这值得进一步研究。

结论

总之，我们提出使用已确立的抗糖尿病药物Ex-4作为急性RIR后神经损伤的潜在治疗干预措施。我们的发现揭示了Ex-4在其糖尿病及其并发症的传统作用之外，还展现出神经保护潜力。从神经血管的角度，我们研究了Ex-4的神经保护机制，并确定了E-EVs中的miR-450b-5p作为RGC损伤的关键调控靶点。本研究证明Ex-4是治疗IR诱导的眼部神经退行性变的有前途的候选药物，其潜在应用可扩展到更广泛的缺血性神经系统疾病。