基于聚多巴胺介孔微球负载雷公藤红素联合光热疗法靶向治疗骨肉瘤的工程学研究

《International Journal of Nanomedicine》：Engineering Study on Targeted Therapy of Osteosarcoma Using Tripterine Loaded Polydopamine Mesoporous Microspheres Combined with Photothermal Therapy

本文推荐一项创新性研究，开发了叶酸修饰的介孔聚多巴胺-聚乙二醇（MPDA-PEG）纳米球负载雷公藤红素（CLT）的靶向递送系统（MPDA-PEG-CLT），用于骨肉瘤的化疗-光热协同治疗。该系统具有高载药量（~14%）、优异的光热转换效率（37.6%，808 nm）及近红外（NIR）响应释放特性，能有效诱导肿瘤细胞线粒体凋亡，并改善骨微环境促进成骨分化，为术后骨肉瘤治疗与修复提供了新策略。

　　

引言

骨肉瘤是一种常见的原发性恶性骨肿瘤，具有恶性程度高、转移性强及预后差的特点，给临床治疗带来持续挑战。手术仍是其主要治疗方式，但术后5年生存率仍低于20%。辅助化疗药物如甲氨蝶呤（MTX）、阿霉素（ADR）和顺铂（DDP）被用于减少术后转移和复发，但骨组织独特的微环境增强了肿瘤细胞对放化疗的抵抗力，显著影响疗效。肿瘤微环境中的缺氧、酸性条件及癌症相关成纤维细胞（CAFs）重塑细胞外基质（ECM），增加组织密度，形成物理屏障阻碍药物渗透。此外，成骨细胞与破骨细胞的相互作用也可能在耐药机制中发挥作用，导致骨肉瘤细胞耐药并引发不良反应。因此，探索新的治疗策略以改善骨肉瘤治疗效果迫在眉睫。

雷公藤红素（CLT）是一种天然生物活性化合物，在免疫和神经退行性疾病中发挥关键作用。近期研究表明，CLT可通过甲羟戊酸和内质网应激等途径诱导肿瘤细胞凋亡并影响骨肉瘤细胞命运，是一种有前景的骨肉瘤化疗候选药物。值得注意的是，CLT还能通过增强PGC-1α信号通路调节骨组织微环境，促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化。这些卓越的生物学特性表明CLT具有清除术后残留肿瘤细胞和重建病灶区域的潜力。然而，CLT的全身给药受到严重器官毒性、水溶性差和肠道通透性低的限制，降低了口服给药的疗效并限制了其临床应用。因此，开发精确靶向递送CLT的策略以最大化治疗效果同时最小化副作用成为当前研究的焦点。

纳米粒子递送系统具有靶向递送、缓释和协同效应等优势，能有效增强负载药物的抗肿瘤活性。金属有机框架（MOFs）和巨噬细胞衍生细胞囊泡（MCVs）等方法是其中的代表。其中，聚多巴胺（PDA）纳米球因其合成简单、易于修饰以及在化学、生物、医学和材料科学中的广泛应用而受到关注。它们可以通过物理吸附或化学结合封装多种活性剂，如化疗药物、光敏剂、基因和免疫抑制剂，促进化疗、光动力疗法和免疫治疗的应用。此外，PDA微球表现出优异的近红外（NIR）诱导光热效应。当与靶向药物递送结合时，它们有望作为协同治疗骨肉瘤的方法，克服传统化疗的局限性。肿瘤部位升高的温度可进一步增强药物释放并增加肿瘤细胞对治疗剂的敏感性。

PDA通过非共价π-π和氢键相互作用与芳香药物结合的能力使其成为CLT的理想载体，形成创新的纳米靶向药物递送系统。PDA纳米球的介孔结构显著提高了载药能力（DLC），促进了CLT的有效负载。该设计与先进的纳米载体策略一致，利用材料特性（如MOF孔隙率、PDA π-π堆叠）优化药物负载和控制释放。

材料与方法

材料

盐酸多巴胺、Pluronic F127、1,3,5-三甲基苯购自阿拉丁生物技术有限公司（中国上海）。雷公藤红素（CLT）、NH₂·PEG·FA（97%，平均分子量2000）购自上海麦克林生化技术有限公司。丙酮、过氧化氢（30%，H₂O₂）、无水乙醇和氨水（25%~28%，NH₃·H₂O）购自中国医药化学试剂有限公司（中国上海）。骨肉瘤细胞系143B购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（目录号：TCHu264）。二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、钙黄绿素乙酰甲氧基（AM）和碘化丙啶（PI），以及线粒体膜电位和凋亡检测试剂盒（Mito-Tracker Red CMXRos和Annexin V-FITC）购自碧云天生物技术有限公司（中国上海）。CCK-8试剂购自日本DojinDo。花青胺染料（CY5-amine）购自重庆玉淇医疗技术有限公司（中国重庆）。兔多克隆抗体Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、Bax、Bcl-2购自Affinity生物技术有限公司（中国江苏）。山羊抗兔IgG H&L抗体购自北京博奥森生物技术有限公司（中国北京）。细胞色素C小鼠单克隆抗体（Cytochrome C）、Tomo20和Alexa Fluor^? 488 conjugate、Alexa Fluor^? 594 conjugate抗体购自Cell Signaling Technology（美国丹弗斯）。所有化学品均按收到状态使用，无需进一步纯化。

介孔聚多巴胺纳米球（MPDA）的合成与表面修饰

采用改良的乳液诱导界面组装法合成MPDA纳米球。将1.2 g F127、1 g盐酸多巴胺和1.6 mL TMB加入50 mL水和50 mL乙醇的混合物中，超声形成乳液。然后加入2 mL氨水，在60°C下搅拌3小时。反应产物通过离心收集，并用水洗涤数次，获得粒径约80 nm的MPDA颗粒。通过改变反应温度（20°C，~200 nm）可获得不同尺寸的MPDA。为改善MPDA的表面性能并使其能够靶向骨肉瘤细胞，使用NH2-PEG-FA（97%，平均分子量2000）对MPDA进行修饰，并通过截留分子量为10,000 Da的透析袋过滤去除多余的NH2-PEG-FA，所得MPDA-PEG纳米球置于4°C供后续实验使用。

表征

通过将溶液滴加到碳涂层铜网上，在加速电压10 KV下使用透射电子显微镜（JEOL JEM-F200，日本）拍摄纳米球的透射电子显微镜（TEM）图像及进行元素分析。使用马尔文Zetasizer Nano ZS90分析仪（马尔文仪器，英国）测量纳米粒径和Zeta电位。使用全自动比表面和孔隙度分析仪（Micromeritics ASAP 2460，美国）测量样品的比表面积、孔径分布和孔体积。使用傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Fisher Scientific Nicolet iS20，美国）测量傅里叶变换红外光谱（FT-IR）。使用激光拉曼光谱仪（Thermo Scientific DXR，美国）测量拉曼光谱，激发波长为532 nm。使用808 nm连续近红外激光（深圳红外激光技术有限公司，中国）进行光热效应测试，光斑尺寸为8 mm和10 mm。使用高精度红外热像仪（guidesensmart，中国）拍摄热成像图片。

生物降解性测试

将过氧化氢溶液（5 mM、10 mM）与MPDA悬浮液（100 μg/mL）混合，搅拌24小时，每小时取样一次。然后使用808 nm处的吸光度评估生物降解性。

光热性能测定

将100 μL MPDA-PEG（100 μg/mL）纳米球滴入96孔板。用808 nm连续近红外激光（2 W cm^?2）照射5分钟后，用红外热像仪测量温度。根据报道的方法测定MPDA-PEG纳米球的光热转换效率（η）。详细计算如下：

η = (hSΔTmax - Qs) / (I(1-10^-A)) × 100%

其中，h为传热系数，S为容器表面积，ΔTmax为纳米粒子悬浮液在最高稳态温度下的温度变化。ΔTmax,s表示溶剂（如H₂O）在最大稳态温度下的温度变化；Qs表示与溶剂近红外光吸收相关的热量。I为入射激光功率密度（2 W cm^?2），A为纳米球在808 nm处的吸光度。τ为样品系统时间常数，可通过温度冷却时间对其ln(ΔT/ΔTmax)进行线性曲线拟合确定。m_s和C_s分别为溶剂（纯水）的质量和热容。

CLT负载与释放测定

为将CLT负载到MPDA-PEG的介孔通道中，将10 mg MPDA-PEG纳米球与3 mg CLT分散于3 mL丙酮中，室温搅拌，蒸发三分之二体积丙酮后，通过离心收集负载CLT的MPDA-PEG纳米球（MPDA-PEG-CLT），并用去离子水洗涤三次以去除表面吸附的CLT。为测定MPDA-PEG-CLT的载药量（DLC）与包封效率，将100 μL MPDA-PEG-CLT用400 μL蒸馏水洗脱，洗脱液通过Sephadex G50柱三次。使用紫外-可见分光光度计在425 nm处测量MPDA-PEG中CLT的紫外吸收值（m2）。然后，将100 μL MPDA-PEG-CLT用400 μL蒸馏水稀释，直接测定总CLT的紫外吸收值（m1），MPDA-PEG-CLT的总量为m3。根据以下公式计算包封效率和载药率：

包封效率(%) = (m2 / m1) × 100%

载药率(%) = (m2 / m3) × 100%

为研究CLT的释放特性，将5 mg MPDA-PEG-CLT纳米球分散于5 mL PBS中。然后将样品转移至透析袋中，对20 mL PBS缓冲液透析，并在黑暗环境中振荡。每小时从溶液中取出2 mL并补充2 mL新鲜PBS。所有药物释放结果均为三次测量的平均值。为研究NIR照射对药物释放性能的影响，将MPDA-PEG-CLT（1 mg mL^?1）在NIR照射下孵育，并使用紫外-可见分光光度计在425 nm处测量CLT的释放浓度。

体外细胞活力测定

将143B细胞（人骨肉瘤细胞系）培养于含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养基中。MSCs（小鼠骨髓基质细胞）培养于含10%（v/v）胎牛血清的MEM培养基中。将细胞在96孔培养板中孵育24小时。随后，用不同浓度的MPDA-PEG纳米粒子分散液处理细胞，并孵育24小时。最后，使用CCK-8测定细胞活力。

细胞摄取测定

通过将20 mg MPDA-PEG纳米球与5 mg CY5-amine在二甲基亚砜（DMSO）/PBS（v/v, 1/99）溶液中混合，并在黑暗环境中磁力搅拌24小时，制备Cy5修饰的MPDA-PEG纳米球用于细胞摄取实验。通过倒置荧光显微镜测定Cy5修饰的MPDA-PEG-CLT纳米球的细胞摄取能力。将143B细胞与MSCs细胞在24孔板中培养12小时，并与Cy5修饰的MPDA-PEG纳米球共孵育4小时。然后用DAPI染色15分钟，使用倒置荧光显微镜拍摄荧光图像。

体外光热治疗与化疗测定

将143B细胞接种于96孔板中，孵育24小时后进行分组处理。对于MPDA-PEG + 激光和MPDA-PEG-CLT + 激光组，用MPDA-PEG/MPDA-PEG-CLT纳米球处理143B细胞4小时，并用近红外激光（808 nm, 2W cm^?2）照射5分钟。然后在额外孵育24小时后测量治疗效果。为测定MPDA-PEG、CLT和MPDA-PEG-CLT组的治疗效果，将MPDA-PEG、游离CLT和MPDA-PEG-CLT纳米球加入143B细胞中，直接孵育24小时后测定治疗效果。

活/死细胞活力测定

将143B细胞与MSCs细胞在24孔板中培养12小时，其中加入CLT、MPDA-PEG和MPDA-PEG-CLT孵育4小时，然后MPDA-PEG + 激光和MPDA-PEG-CLT + 激光组在808 nm激光照射下照射5分钟。随后，用钙黄绿素-AM和碘化丙啶（PI）染色15分钟。使用倒置荧光显微镜拍摄细胞荧光图像。

细胞周期与凋亡测定

将细胞接种于6孔板中，与CLT、MPDA-PEG和MPDA-PEG-CLT共孵育4小时。然后MPDA-PEG + 激光和MPDA-PEG-CLT + 激光组在808 nm激光下照射5分钟，并置于细胞培养箱中24小时。用于细胞周期分析的细胞用胰蛋白酶（Hyclone）消化，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并在4°C下用70%乙醇固定过夜。细胞在500 g下离心5分钟，用冷PBS洗涤两次，并离心。用RNase A（0.1 mg/mL）处理并用碘化丙啶（PI, 0.05 mg/mL; 4A Biotech北京，中国）在37°C下染色30分钟后，通过荧光激活细胞分选进行细胞周期分析。为分析凋亡，细胞用胰蛋白酶消化后，进行两次PBS洗涤步骤。使用Annexin V/PI检测试剂盒（4A Biotech，北京，中国）在室温下染色5分钟。使用流式细胞仪（Beckman Coulter）测定凋亡细胞。所有实验至少重复三次。

线粒体膜电位与凋亡检测

将143B细胞在24孔板中培养12小时，其中加入CLT、MPDA-PEG和MPDA-PEG-CLT共孵育4小时，然后MPDA-PEG + 激光和MPDA-PEG-CLT + 激光组在808 nm激光下照射5分钟。随后，将其置于细胞培养箱中再孵育12小时。然后，使用线粒体膜电位和凋亡检测试剂盒检测各组线粒体膜电位和凋亡的变化。

Western Blotting

使用补充了蛋白酶（04693159001, Roche, Switzerland）和磷酸酶抑制剂（4906837001, Roche）的细胞裂解缓冲液（P0013, Beyotime, 上海，中国）提取蛋白质样品。然后，将1/5体积的上样缓冲液加入细胞裂解液中，在100°C下加热10分钟。蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将印迹在5%牛血清白蛋白中于25°C下封闭2小时，然后在4°C下与特异性抗体Caspase 3（Affinity,1:1000, #AF7022）、Caspase 9（Affinity,1:1000, #AF5240）、Bax（Affinity,1:1000, #AF0120）和Bcl-2（Affinity,1:1000, #AF6139）孵育过夜。将印迹与辣根过氧化物酶偶联的二抗（Bioss, 1:5000, #bs-0295G）在25°C下孵育2小时。最后，每张膜用ECL（SQ202, Epizyme, 上海，中国）曝光。

骨肉瘤细胞线粒体凋亡的免疫荧光检测

将143B细胞在24孔板中培养12小时，其中加入CLT、MPDA-PEG和MPDA-PEG-CLT共孵育4小时，然后MPDA-PEG + 激光和MPDA-PEG-CLT + 激光组在808 nm激光下照射5分钟。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞三次，并用4%多聚甲醛固定15分钟。再用PBS洗涤三次后，使用0.5% Triton X-100（溶于PBS）在室温下处理20分钟。在用PBS再洗涤三次后，用山羊血清封闭30分钟，然后在4°C下与细胞色素C（HUABIO, 1:100, M1701-9）和Tomo20（Cell Signaling Technology, 1:100, 42406）抗体孵育过夜。第二天用TBST洗涤三次后，滴加荧光二抗（Alexa Fluor^? 488 Conjugate（Cell Signaling Technology, 1:100, 4408S）、Alexa Fluor^? 594 Conjugate（Cell Signaling Technology, 1:100, 8889S）），并在室温湿润 chamber 中孵育1小时。再用TBST洗涤三次后，用DAPI染色15分钟，使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄细胞荧光图像。

骨髓基质细胞的提取与培养

按照所述方法提取和培养原代BMSCs，并在含有10%胎牛血清（ExCell Bio，中国）的α-MEM中培养。每2至3天更换一半培养基。BMSC在接种后第7或8天传代一次，并以1.5×10⁵ cells/cm²重新接种用于成骨细胞分化实验。

成骨细胞分化测定

检测碱性磷酸酶（AP）活性和表达以评估成骨细胞分化。简言之，将BMSCs重新铺板于24孔板中过夜。第二天，用雷公藤红素（0.4 μM）处理细胞三天。使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行AP染色测定。进行定量实时PCR（qPCR）检测成骨细胞标志基因表达。

矿化测定

按照先前描述的方法测试骨结节形成。简言之，细胞在完全生长培养基中生长至汇合，并在含有50 mg/L抗坏血酸和10 mM β-甘油磷酸钠的成骨培养基中培养14天。显微镜下观察骨结节形成，并通过茜素红S染色检测和定量矿化，使用纯水脱色后通过吸光度测定定量矿化。

定量PCR

使用Trizol（Invitrogen, CA, USA）处理细胞后提取总RNA。根据逆转录反应试剂盒说明（TAKARA, Japan）从提取的总RNA合成cDNA。将合成的cDNA稀释5倍，并保存在?20°C直至用作qPCR的模板和引物组（表1）。使用2^?ΔΔCT方法将看家基因Gapdh的相对mRNA表达水平标准化。

体内治疗

将143B细胞系皮下接种到裸鼠中制备皮下骨肉瘤肿瘤模型，并向尾静脉注射100 μL CY5修饰的MPDA-PEG纳米粒子悬浮液（4 mg mL^?1），使用小动物荧光活体成像仪在不同时间点拍摄MPDA-PEG纳米球在裸鼠中的靶向聚集效果。

当肿瘤体积达到80 mm³时，将小鼠分为6组（n=5）：对照组、CLT组、MPDA-PEG-CLT组、MPDA-PEG + 2 W cm^?2激光组和MPDA-PEG-CLT + 2 W cm^?2激光组。CLT组小鼠静脉注射100 μL（0.6 mg mL^?1）游离CLT。MPDA-PEG-CLT、MPDA-PEG + 2W cm^?2激光和MPDA-PEG-CLT + 2W cm^?2激光组小鼠静脉注射100 μL MPDA-PEG/MPDA-PEG-CLT纳米粒子悬浮液（4 mg mL^?1）。注射后4小时将肿瘤暴露于808 nm NIR激光。用红外相机记录肿瘤部位的温度。每隔一天测量肿瘤大小和小鼠体重。第14天，处死小鼠，解剖肿瘤和主要器官（心、肝、肺和肾），并用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织学分析。

统计分析

本文所有数据均以平均值±标准差表示。使用非配对学生t检验比较两个测试组之间的差异，概率（P）小于0.05被认为具有统计学显著性。

结果与讨论

MPDA-PEG的制备与表征

采用并改良报道的乳液诱导界面组装法制备了具有介孔结构的MPDA纳米球。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像如图1A和B所示。MPDA纳米球的粒径分布均匀，介孔呈放射状排列，主要成分由C、N和O元素组成（图1C）。TEM图像显示MPDA的介孔尺寸约为15-20 nm。

然后通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和拉曼光谱对不同直径的MPDA-PEG纳米球进行表征。FT-IR光谱如图1D所示，约3400 cm^?1处的峰归因于N-H和O-H羟基的伸缩振动，1616 cm^?1处的明显峰是芳香环C=C双键的伸缩振动。这些官能团赋予MPDA-PEG纳米球活性表面修饰能力。如图1E所示，拉曼光谱提供了MPDA-PEG纳米球无序和缺陷结构的信息。观察到两个强峰，中心在1350和1560 cm^?1，1350 cm^?1处的振动信号归因于2D六方结构晶格的sp2碳（D带），而1560 cm^?1处的振动信号对应于面内芳香结构环的sp2碳（G带）。这表明所获得的介孔聚多巴胺纳米球可能具有高密度空位结构。

为增强MPDA在生理介质中的稳定性和分散性，以实现其未来在生物体中的应用目的，在碱性条件（pH 12.0）下通过迈克尔加成/希夫碱反应使用NH2·PEG对MPDA进行PEG功能化。如图1F所示，PEG修饰的MPDA（MPDA-PEG）纳米球的Zeta电位从?31mV变为?16mV，证明PEG成功修饰在MPDA纳米球表面，这有助于延长负载药物的循环时间。如图1G所示，修饰后的MPDA-PEG纳米球和MPDA纳米球的粒径变化不大（约80 nm）。此外，如图1H所示，PEG修饰的MPDA纳米球在生理介质（FBS）中长时间（约14天）表现出良好的稳定性；另外，测试了在FBS中处理不同时间的PEG修饰MPDA纳米球的粒径，发现处理2天和14天的MPDA纳米球粒径变化不大（图1I），这表明PEG修饰的MPDA纳米球在生理介质（FBS）中具有良好的长期稳定性，有利于进一步的生物应用。

MPDA-PEG的光热效应

近年来，具有高NIR吸收和光热转换效率的纳米材料已广泛应用于PTT。在本研究中，为研究MPDA-PEG纳米球的光热效应，我们合成了PEG修饰的MPDA纳米球（直径约80和200 nm，分别定义为MPDA-PEG-80和MPDA-PEG-200）进行比较（TEM图像如图1B所示，FT-IR和拉曼光谱如图1D和E所示）。然后，用808 nm、2 W cm^?2的近红外激光照射MPDA-PEG（100 μg mL^?1）5分钟，并使用红外热像仪记录温度变化。如图2A和B所示，MPDA-PEG-200纳米球可将温度从18°C升高至66.5°C（ΔT = 48.5°C），而MPDA-PEG-80纳米球将温度从18°C升高至42.5°C（ΔT = 24.5°C）。此外，与PBS相比，MPDA-PEG具有更好的光热效应（图2C）。以上结果表明，MPDA-PEG纳米球的光热效应随尺寸增大而增强，但在肿瘤热疗应用中，瘤内温度通常控制在39.5–45.0°C，更可能引起细胞坏死。结合其他抗肿瘤治疗时，温度可适当降低。当温度超过45°C时，体内正常组织细胞也会受损。综上所述，我们选择MPDA-PEG-80纳米球进行下一步研究。

为检测MPDA-PEG-190优异的光热效应，首先通过重复暴露于近红外激光照射（808 nm, 2 W cm^?2）三个循环来检查MPDA-PEG纳米球的光热稳定性。在3次NIR激光暴露循环中几乎未观察到热疲劳阻力损失（图2D）。其次，我们计算了MPDA-PEG纳米球的光热转换效率（η），如图2E所示，MPDA-PEG的η值为37.6%。此外，MPDA-PEG纳米球 thus 被证明具有良好的光热稳定性。

肿瘤组织处于酸性微环境中且过氧化氢过多，而H₂O₂也广泛分布于巨噬细胞和主要器官中。因此，在过氧化氢存在下研究了MPDA-PEG纳米球的生物降解性。结果表明，随着反应时间的延长和H₂O₂浓度的增加，MPDA-PEG在808nm处的吸收降低（图2F和G）。这些结果表明MPDA-PEG纳米球具有良好的生物降解性。

雷公藤红素负载与释放

由于雷公藤红素水溶性差、器官毒性显著且肠道通透性差，其应用受到限制。MPDA-PEG具有介孔结构，是雷公藤红素的理想药物递送载体，可解决雷公藤红素无法靶向肿瘤引起的体内毒性问题。

因此，我们研究了MPDA-PEG-190纳米球的雷公藤红素负载能力。如图3A所示，通过FT-IR光谱证实了雷公藤红素的成功负载。雷公藤红素光谱在1718和1244 cm^?1处显示特征吸收，分别归因于C=O和C-O的对称或不对称伸缩。雷公藤红素负载到MPDA-PEG颗粒后，新峰位于1718 cm^?1和1244 cm^?1，证实雷公藤红素已负载到MPDA-PEG中。MPDA-PEG和负载雷公藤红素的MPDA-PEG（MPDA-PEG-CLT）纳米球的氮吸附-脱附等温线实验（图3B和C）显示，由于雷公藤红素成功负载到MPDA-PEG纳米球的介孔通道中，MPDA-PEG纳米球的比表面积和孔体积分别从286 m² g^?1和0.32 cm³ g^?1降至44 m² g^?1和0.12 cm³ g^?1。随后，进一步计算了MPDA-PEG纳米球的包封效率和载药率。发现MPDA-PEG可有效负载雷公藤红素分子（D