AFG3L2负调控SLC25A39介导线粒体氧化应激促进肺腺癌恶性进展的机制研究

本研究聚焦肺腺癌（LUAD）治疗耐药难题，揭示线粒体谷胱甘肽转运蛋白SLC25A39通过激活NOTCH信号通路和维持线粒体功能（包括OXPHOS和ROS平衡）的关键作用。研究人员发现AFG3L2蛋白酶通过降解SLC25A39抑制肿瘤生长，为LUAD提供了新的生物标志物和治疗靶点。该成果发表于《npj Precision Oncology》，为靶向线粒体代谢的精准治疗策略奠定理论基础。

　　

肺癌至今仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占全部肺癌病例的85%，而肺腺癌（LUAD）是最常见的NSCLC亚型。尽管诊断技术和治疗策略的进步改善了临床结果，但大多数晚期LUAD患者最终会对当前治疗产生耐药性，导致疾病进展。因此，迫切需要为LUAD确定新的治疗靶点和开发创新治疗方法。

线粒体作为细胞中至关重要的细胞器，负责能量生产、代谢调节和信号转导。除了这些基本功能，线粒体还深度参与癌细胞的存活、免疫逃逸、肿瘤进展以及耐药性的发展，尤其是在肿瘤微环境（TME）的缺氧条件下。然而，维持肿瘤生长所需的高线粒体活性往往导致线粒体活性氧（mtROS）产生增加、线粒体DNA突变积累和线粒体功能障碍。过量的mtROS如果不加以控制，会损伤线粒体蛋白质并损害细胞活力。这些脆弱性使得线粒体作为癌症治疗中潜在靶点受到越来越多的关注。

谷胱甘肽（GSH）是真核细胞中普遍存在的含硫醇抗氧化剂，在维持氧化还原稳态中起核心作用。鉴于线粒体是氧化代谢的主要场所，维持足够的线粒体GSH水平对于保护线粒体功能和支持生物合成过程至关重要。Wang等最近的研究发现，溶质载体家族25成员39（SLC25A39）是介导线粒体GSH摄取的关键转运蛋白，其活性与细胞代谢状态密切相关，并具有功能冗余的特点。Kawase等进一步证明，SLC25A39和SLC25A40协同调节线粒体GSH转运，其中SLC25A40的表达受Toll样受体4（TLR4）和晚期糖基化终末产物受体（RAGE）信号通路的影响。此外，研究还将SLC25A39与金属稳态和神经元损伤联系起来，并确定其为帕金森病的遗传风险因素。更重要的是，SLC25A39已被证明在线粒体血红素生物合成中起关键作用，其沉默会损害小鼠红白血病细胞中原卟啉IX的铁掺入。

尽管有这些发现，SLC25A39在癌症特别是LUAD中的作用仍知之甚少。在这项研究中，我们研究了SLC25A39在LUAD中的功能意义并探索了其潜在作用机制。

关键技术方法概述

本研究使用21对LUAD患者肿瘤与癌旁组织样本进行qRT-PCR和Western blot验证；通过CRISPR/Cas9基因敲除和慢病毒过表达构建稳定细胞系；采用CCK-8、克隆形成、EdU染色和Transwell实验评估细胞增殖迁移；通过活性氧（ROS）检测、线粒体膜电位（JC-1）、ATP含量和线粒体复合物I活性测定分析线粒体功能；利用co-IP联合质谱分析筛选互作蛋白；使用裸鼠皮下移植瘤模型进行体内验证；采用生物信息学分析TCGA和GEO数据库的表达与预后数据。

SLC25A39在LUAD中异常表达并与不良预后相关

通过生物信息学分析发现，SLC25A39在LUAD肿瘤组织与正常肺上皮组织中的转录组表达水平无显著差异。qRT-PCR检测21对LUAD肿瘤和癌旁组织中的SLC25A39 mRNA水平，证实缺乏显著差异。Kaplan-Meier生存分析显示，SLC25A39高表达患者总生存期显著缩短。Western blot分析显示LUAD肿瘤组织中SLC25A39蛋白水平显著高于正常组织。在人气道上皮细胞系BEAS-2B、多个LUAD细胞系（H1975、H1650、A549、H1299）和原代LUAD细胞系（pLUAD1）中，qRT-PCR显示SLC25A39 mRNA水平无显著差异。线粒体分离免疫印迹证实SLC25A39蛋白在线粒体组分中富集，且在LUAD细胞系中表达升高。免疫组化染色显示5例代表性LUAD患者肿瘤组织中SLC25A39蛋白表达显著增加。多色免疫荧光证实SLC25A39与线粒体标志物HSP60共定位，在肿瘤组织中明显过表达。免疫荧光成像显示SLC25A39蛋白（绿色荧光）与MitoTracker（红色荧光）共定位，证实线粒体定位和在LUAD细胞系中表达升高。

SLC25A39异位表达促进LUAD恶性进展

在A549和H1299细胞中转导编码SLC25A39的慢病毒载体（oeSLC25A39）或空载体对照（Vec），使用嘌呤霉素选择稳定细胞系。SLC25A39过表达通过mRNA和蛋白水平显著增加确认，而SLC25A40表达不变。CCK-8检测显示，oeSLC25A39细胞相比对照细胞活力显著增强。SLC25A39过表达促进细胞增殖，表现为克隆形成增加和EdU阳性核比例增高。Transwell迁移实验显示过表达SLC25A39的细胞迁移能力显著增加。

SLC25A39缺失抑制LUAD细胞增殖和迁移

通过用靶向SLC25A39的CRISPR/Cas9载体转导表达Cas9的A549和H1299细胞，生成稳定的SLC25A39敲除细胞系（koSLC25A39）。Western blot证实koSLC25A39细胞中SLC25A39蛋白几乎完全缺失，而SLC25A40表达基本不变。添加50μM外源GSH后，敲除细胞仍表现持续降低的活力，表明外源GSH无法完全挽救线粒体内膜GSH转运蛋白SLC25A39缺失导致的活力缺陷。SLC25A39敲除显著损害克隆形成并降低EdU阳性增殖细胞比例。Transwell迁移实验显示迁移能力显著下降。使用两种不同的靶向SLC25A39的慢病毒shRNA（SLC25A39-sh1和SLC25A39-sh2）沉默A549和H1299细胞中SLC25A39表达，稳定敲低通过qRT-PCR和Western blot确认，显示SLC25A39 mRNA和蛋白水平大幅降低，对SLC25A40表达影响最小。SLC25A39敲低显著降低细胞活力、增殖和迁移。

SLC25A39介导LUAD细胞中NOTCH信号通路激活

通过分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库中的差异表达基因并进行基因集富集分析（GSEA），发现NOTCH信号通路在SLC25A39高表达样本中显著富集。Western blot检测SLC25A39敲除（koSLC25A39）和过表达（oeSLC25A39）的LUAD细胞中NOTCH通路关键组分（HEY1、HES1和NOTCH1）的蛋白水平。SLC25A39敲除显著降低HEY1、HES1和NOTCH1的表达，而SLC25A39过表达显著上调这些蛋白。

SLC25A39缺陷导致LUAD细胞线粒体功能紊乱和凋亡激活

通过分析TCGA数据库中与SLC25A39最相关的top500基因，GO富集分析显示显著富集于线粒体相关功能，主要定位于线粒体内膜，涉及ATP合成耦合电子传输、线粒体呼吸链复合物I组装和从NADH到泛醌的电子转移等关键线粒体过程。在SLC25A39敲除（KO）后评估线粒体功能，与对照相比，SLC25A39缺陷的A549和H1299细胞表现出显著升高的活性氧（ROS）水平、线粒体呼吸链复合物I活性显著降低、单链DNA（ssDNA）积累表明DNA损伤增加。线粒体膜电位分析显示从JC-1红色聚集体向绿色单体转变，反映线粒体去极化，与细胞内ATP水平降低相关。SLC25A39缺陷还导致凋亡细胞群显著增加，TUNEL阳性核增多，caspase-3活性升高，pro-caspase-3和pro-caspase-9表达降低而它们的切割活性形式增加，组蛋白结合DNA含量升高。使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理可显著减弱敲除细胞中的ROS积累并部分挽救凋亡。透射电镜显示SLC25A39敲除导致严重的线粒体结构损伤，特征为线粒体嵴丢失或减少。

AFG3L2通过影响其稳定性抑制SLC25A39的促癌功能

将Flag标记的SLC25A39质粒（Flag-SLC25A39）转染293T细胞，使用Flag抗体进行co-IP。银染色证实免疫沉淀样品中Flag-SLC25A39有效富集。质谱分析鉴定出互作蛋白，其中AFG3样基质AAA肽酶亚基2（AFG3L2）作为关键互作蛋白被突出显示。内源性Co-IP实验证实A549和H1299细胞中SLC25A39与AFG3L2的相互作用。外源性Co-IP使用FLAG标记的SLC25A39和HA标记的AFG3L2在瞬时转染的A549和H1299细胞中进一步验证此相互作用。使用GEO数据集GSE139032分析AFG3L2表达，发现LUAD肿瘤组织中AFG3L2 mRNA相比正常对照显著下调。Kaplan-Meier生存分析表明较高的AFG3L2表达与改善的患者预后相关。LUAD肿瘤组织中AFG3L2的mRNA和蛋白水平均显著降低。通过CRISPR/Cas9生成AFG3L2敲除的A549和H1299细胞系，功能实验表明AFG3L2缺失显著增强LUAD细胞生长、增殖和迁移。Western blot分析显示AFG3L2敲除显著增加SLC25A39蛋白水平，而SLC25A40表达不变。AFG3L2缺陷延长SLC25A39蛋白的半衰期。基于先前报道，生成缺失该片段（△aa72-86）的缺失突变体，当将FLAG标记的野生型（WT）和△aa72-86 SLC25A39质粒转染到AFG3L2敲除的A549细胞中时，只有WT SLC25A39表达被AFG3L2缺失显著升高，而△aa72-86表达不受影响。放线菌素D追踪实验进一步证明缺失aa72-86片段显著稳定外源性SLC25A39蛋白。在AFG3L2过表达的LUAD细胞中转染SLC25A39过表达载体（oeSLC25A39），Western blot显示SLC25A39过表达部分恢复被AFG3L2过表达抑制的蛋白水平。功能上，SLC25A39过表达部分逆转AFG3L2过表达对LUAD细胞迁移和增殖的抑制作用。外源性SLC25A39还显著降低AFG3L2过表达诱导的活性氧（ROS）积累和凋亡。

SLC25A39缺失抑制体内皮下异种移植瘤生长

通过将2x10^6个A549细胞（Cas9对照（Cas9C）或SLC25A39敲除（koSLC25A39））皮下注射到裸鼠左腋窝建立异种移植模型。第25天处死小鼠，切除肿瘤，测量重量和体积。koSLC25A39组肿瘤显著减小，而两组小鼠体重无显著差异。Western blot分析证实koSLC25A39肿瘤中SLC25A39蛋白大幅减少，SLC25A40表达无显著变化。PARP切割增加和caspase-3活性升高进一步支持凋亡诱导。免疫组化染色显示koSLC25A39肿瘤中SLC25A39表达几乎完全缺失，Ki-67染色表明SLC25A39缺失后肿瘤细胞增殖减少。TUNEL阳性核显著增加和caspase-3阳性染色证实体内SLC25A39缺陷肿瘤中凋亡增强。

研究结论与意义

本研究确立了SLC25A39作为LUAD中的促癌因子，其异常上调与AFG3L2下调相关。研究发现AFG3L2通过降解SLC25A39抑制肿瘤生长，而SLC25A39通过维持线粒体功能（包括OXPHOS和ROS平衡）和激活NOTCH信号通路促进LUAD进展。重要的是，SLC25A39的aa72-86环状结构域对其被AFG3L2招募和后续降解至关重要。这些发现为LUAD提供了新的生物标志物和治疗靶点，为开发靶向线粒体代谢的精准治疗策略奠定了理论基础。

然而，针对SLC25A39的治疗策略仍面临挑战，因为SLC25A39位于线粒体内膜，药物需要设计成能够穿透线粒体膜以实现靶向递送；此外，SLC25A39参与正常细胞的线粒体代谢，治疗靶向需要谨慎评估以避免因干扰正常线粒体代谢而产生的全身毒性。本研究为LUAD的精准治疗提供了新的有效解决方案。