稳定转染CD16的NK92细胞联合Daratumumab在体外及体内高效靶向多发性骨髓瘤的治疗潜力

本综述系统探讨了NK细胞疗法与单克隆抗体（如daratumumab）联合治疗多发性骨髓瘤（MM）的新策略。研究通过基因工程构建稳定表达CD16的NK92细胞系（NK92-CD16），显著增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）效应，并在二维（2D）、三维（3D）培养及小鼠体内模型中验证其高效杀伤MM细胞的能力，为复发/难治性MM提供了具有临床转化潜力的免疫治疗新方案。

　　

引言

自然杀伤细胞（NK细胞）作为先天免疫系统的关键效应细胞，不仅能够控制病毒感染（特别是下调MHC-I表达的疱疹病毒科成员），还在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。早期研究发现NK细胞具备体外杀伤肿瘤细胞的能力，随后研究进一步证实其在癌症免疫监视中的核心地位。作为先天免疫细胞，NK细胞不表达特异性抗原受体，无需预先暴露于靶标即可激活，并能快速执行免疫反应，在某些情况下甚至表现出类似免疫记忆的功能特征。NK细胞能够选择性杀伤肿瘤细胞而不损伤健康细胞，这使得基于NK细胞的免疫治疗成为极具潜力的治疗策略。然而，NK细胞在血液中占比极小，其扩增和激活需要复杂条件，成为临床应用的主要挑战。

为获取大量高活性NK细胞，多种体外激活扩增方案已被开发。本研究团队建立的扩增方案基于外周血单核细胞或脐带血细胞在IL-15加IL-2以及灭活饲养细胞存在下的培养体系，可实现50倍以上的扩增率，并显著增强对癌细胞的细胞毒性。更重要的是，扩增后的细胞（eNK）大多不表达CD279（PD-1），这意味着即使靶细胞表达协同抑制配体CD274（PD-L1），eNK细胞也不会接收到抑制信号。另一种策略是使用永生化NK细胞系，如NK92细胞系，该细胞系具有无限增殖能力（需IL-2补充），为细胞治疗提供了稳定且不受供体影响的细胞来源。

多发性骨髓瘤（MM）是一种以异常浆细胞不受控增殖为特征的恶性肿瘤，在发达国家是第二常见的血液癌症，约占全球所有恶性肿瘤的1%。尽管蛋白酶体抑制剂和免疫调节药物等新疗法显著改善了MM患者的临床结局和生存率，但目前尚无根治性治疗方案。近年来，两种靶向CD269（又称BCMA）的CAR-T细胞疗法获批用于复发MM治疗，虽然疗效显著，但复发仍然常见，这凸显了探索替代细胞疗法（如基于NK细胞的免疫治疗）的必要性。

材料与方法

本研究使用NK92细胞系（源自德国DMSZ），该细胞系源于快速进展的非霍奇金淋巴瘤，是一种高细胞毒性的人NK细胞永生化模型。细胞培养采用αMEM培养基（含12.5%胎牛血清、12.5%马血清、1% GlutaMAX?和1%抗生素），并添加25 IU/ml IL-2。多发性骨髓瘤细胞系MM.1S、NCI-H929和RPMI 8226使用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基培养。

外周血单核细胞（PBMC）从白细胞浓缩液中通过Ficoll?密度梯度离心分离，随后用植物血凝素（10 μg/ml）过夜激活，再在含100 IU/ml IL-2的新鲜培养基中培养5天。eNK细胞的生成采用EasySep人CD3阳性选择试剂盒进行部分T细胞去除，然后在含IL-15（25 IU/ml）和IL-2（100 IU/ml）的培养基中，与经丝裂霉素C处理的HLA-I阴性人B淋巴母细胞系721.221以5:1比例共培养20-25天。最终通过抗CD56磁珠分选获得eNK细胞。

为构建NK92-CD16细胞系，将人高亲和力CD16多态性（158位为缬氨酸）cDNA克隆到pHIV-Luc-ZsGreen载体的EcoRI-XbaI位点（取代荧光素酶cDNA），构建pHIV-CD16-ZsGreen载体。通过聚乙烯亚胺（PEI）转染HEK-293T细胞生产慢病毒颗粒，收集72小时后的病毒上清。NK92细胞通过离心接种法（2400×g，90分钟，32°C）在含IL-2（100 IU/ml）和右旋糖酐（8 μg/ml）的条件下进行两次转导，随后通过流式细胞分选富集ZsGreen阳性细胞，并通过抗CD16 Alexa Fluor? 647标记抗体检测CD16表面表达。

细胞毒性试验中，eNK细胞用1 μM Cell Tracker Green（CTG）标记，与靶细胞按不同效靶比（1:10至5:1）在含或不含daratumumab（5 μg/ml）的条件下共培养4小时。通过annexin V-DY634标记检测靶细胞死亡，流式细胞术分析时通过绿色荧光（CTG或ZsGreen）排除NK细胞。在3D培养条件下，MM细胞重悬于0.25% GrowDex?水凝胶中，NK92-CD16细胞加入后共培养24小时，最后使用GrowDase?降解基质并进行细胞死亡分析。

为临床转化准备，NK92-CD16细胞接受10 Gy或15 Gy剂量照射，照射后监测细胞活力及细胞毒性能力。对于患者样本检测，从MM患者骨髓穿刺液中分离单核细胞（BMMC），通过CD38和CD138表达分析确定MM细胞比例。将5×10⁴ BMMC与NK92-CD16细胞按1:1和3:1比例共培养4小时，通过PE标记的抗CD138抗体和annexin V-DY634检测MM细胞死亡。

体内实验使用免疫缺陷NSG小鼠，分别通过皮下注射5×10⁵ MM.1S-GFP-Luc细胞或静脉注射3×10⁵细胞建立肿瘤模型。治疗组在指定时间点静脉注射5×10⁶ NK92-CD16细胞（单独或联合50 μg daratumumab），并在注射体积中加入IL-2（终浓度100 IU/ml）。通过腹腔注射荧光素（1 mg/ml）后利用IVIS? Lumina III系统监测肿瘤发展，实验终点收取肿瘤组织、脾脏和骨髓，通过流式细胞术分析GFP阳性肿瘤细胞和ZsGreen阳性治疗细胞的浸润情况。

结果

NK92-CD16细胞的成功构建通过慢病毒转导实现，初始转导效率约为0.07%，经过多轮流式分选富集后，ZsGreen阳性细胞比例超过95%。CD16和ZsGreen蛋白表达在近两年内保持稳定，仅出现微小波动。与健康供体来源的eNK细胞相比，NK92-CD16细胞对MM细胞系表现出更强的细胞毒性。特别是在表达高水平CD38的MM.1S和NCI-H929细胞系中，NK92-CD16细胞在效靶比3:1联合daratumumab的条件下，4小时内即可杀死几乎所有MM细胞。细胞毒性增强与靶细胞CD38表达水平呈正相关，RPMI 8226细胞系因CD38表达低且异质（约三分之一细胞CD38阴性）而敏感性较低。

值得注意的是，NK92-CD16细胞本身高表达CD38，而eNK细胞的CD38表达则因供体而异。这意味着与daratumumab联合时可能发生同胞杀伤（fratricide）效应。实验证实NK92-CD16细胞的同胞杀伤率低于eNK细胞平均水平，但这并不影响其对MM细胞系的杀伤效果。在3D培养条件下，NK92-CD16细胞能够有效浸润GrowDex?水凝胶并杀伤MM细胞，其效率与2D培养无显著差异。

对20例MM患者骨髓样本的检测显示，NK92-CD16细胞单独处理可诱导约20%的MM细胞死亡，daratumumab单独处理也显示类似效果（表明患者BMMC中存在活性NK细胞和/或巨噬细胞）。而当两者联合时，细胞毒性显著增强，在效靶比3:1条件下4小时内可清除约80%的MM细胞。特别值得注意的是，部分复发患者样本虽然对NK92-CD16细胞单独处理敏感性较低，但联合daratumumab后敏感性显著提高。CD38表达水平在不同患者间存在差异，但并非治疗反应的唯一预测指标。

安全性实验表明，NK92-CD16细胞对健康供体来源的静止PBMC和活化T母细胞的杀伤率低于20%，显示出良好的肿瘤选择性。为满足临床安全性要求，照射实验表明10 Gy剂量可有效抑制NK92-CD16细胞增殖，照射后48小时内细胞保持80%以上的细胞毒性，而15 Gy照射则导致细胞毒性显著下降。这表明10 Gy照射可在保证安全性的同时保持治疗效能。

体内实验结果显示，在皮下移植瘤模型中，NK92-CD16细胞联合daratumumab治疗组肿瘤生长减缓，切除肿瘤中MM细胞比例显著降低（平均33.1%±0.3%，对照组为42.4%±3%）。虽然肿瘤内NK细胞浸润比例较低（约1%），但证实了治疗细胞的肿瘤浸润能力。在更接近MM病理特征的静脉注射模型中，NK92-CD16细胞单独处理使肿瘤发展减少60%，而联合daratumumab处理在28天时几乎完全消除MM细胞（减少97%）。组织分析显示，联合治疗组脾脏中MM细胞完全清除，但骨髓中MM细胞比例仍高，可能与细胞代谢状态改变有关。有趣的是，联合治疗组NK细胞浸润显著低于单独NK细胞治疗组，提示长期治疗可能引发同胞杀伤。

讨论

尽管多发性骨髓瘤治疗近年来取得显著进展，但该疾病仍然无法根治。CAR-T细胞疗法特别是靶向BCMA的CAR-T为MM治疗带来了新希望，但BCMA阴性或低表达患者的复发以及抗原丢失问题限制了其长期疗效。基于同种异体或自体NK细胞的疗法，特别是经过基因修饰表达CAR的NK细胞，为复发患者提供了有前景的替代方案。与传统T细胞疗法相比，NK细胞疗法具有成本较低、不良反应较少等优势，且更适合与单克隆抗体联合使用。

Daratumumab作为抗CD38单克隆抗体，通过ADCC等机制在MM治疗中显示出显著疗效。本研究通过基因工程手段使NK92细胞系表达CD16受体，成功解决了该细胞系无法进行ADCC的问题。生成的NK92-CD16细胞系在长达两年的培养中保持稳定的CD16表达，展现出卓越的治疗潜力。

实验结果表明，NK92-CD16细胞在体外对MM细胞系具有高度细胞毒性，即使在低效靶比条件下也能有效杀伤肿瘤细胞，且这种杀伤效应在3D培养环境中得以保持。对患者样本的检测显示，该细胞特别是与daratumumab联合时，对包括复发患者在内的多种MM样本均具有显著杀伤效果。照射实验证实10 Gy剂量可平衡安全性与有效性，为临床转化提供了重要参考。

体内研究进一步验证了NK92-CD16细胞的治疗潜力。在两种小鼠模型中，特别是静脉注射模型（更接近MM实际病理状态）中，NK92-CD16细胞联合daratumumab几乎完全消除了MM细胞，显示出近乎治愈的效果。尽管长期治疗可能引发同胞杀伤，但短期疗效令人鼓舞。

与既往研究相比，本研究首次系统评估了CD16转染的NK92细胞在MM治疗中的应用价值。Williams等人的临床研究曾使用NK92细胞治疗5例MM患者，仅1例完全缓解，4例复发进展。而本研究显示的高效杀伤效果表明，基因修饰后的NK92细胞可能具有更好的治疗潜力。此外，既往研究多在乳腺癌或急性髓系白血病模型中验证NK92-CD16细胞的疗效，本研究首次在MM模型中系统评估其价值。

综上所述，稳定表达CD16的NK92细胞联合daratumumab为多发性骨髓瘤特别是复发难治性患者提供了新的治疗选择。其高效杀伤能力、良好安全性以及适用于联合治疗的特点，使其具有重要的临床转化价值。未来研究可进一步探索该策略在其他肿瘤类型中的应用，以及与其他治疗方法的联合使用。