氧化还原调控PD-1/PD-L1/PD-L2相互作用的分子动力学研究及其对癌症免疫治疗的启示

本刊推荐：为探索冷大气等离子体(CAP)对免疫检查点蛋白(ICPs)的调控机制，研究人员通过分子动力学(MD)模拟和增强采样技术，系统研究了CAP诱导氧化对PD-1/PD-L1及PD-1/PD-L2相互作用的分子机制。研究发现氧化作用显著降低PD-1与配体的结合亲和力，为CAP通过调控免疫检查点增强抗肿瘤免疫提供了理论依据，对开发新型癌症免疫治疗策略具有重要意义。

　　

癌症作为全球主要死亡原因，传统治疗方法包括手术、化疗和放疗虽挽救了许多生命，但往往伴随损伤健康组织、全身毒性和影响患者生活质量的副作用。这些挑战凸显了对更新、更精准、更微创治疗方法的迫切需求。冷大气等离子体（Cold Atmospheric Plasma, CAP）作为一种新兴的癌症治疗方式，因其能选择性靶向癌细胞同时保护正常组织而受到广泛关注。CAP在室温和大气压下通过介质阻挡放电（DBDs）、等离子体射流和微等离子体装置产生，可输送生物活性物种并最小化对周围组织的热损伤。

近年来研究证明CAP能选择性诱导多种癌细胞凋亡和抑制增殖，其重要特征是通过产生活性氧氮物种（RONS）使肿瘤细胞更容易发生免疫原性细胞死亡（ICD）。特别值得注意的是，CAP还具有靶向免疫检查点蛋白（ICPs）的潜力，其中程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1和PD-L2是调节癌症免疫的关键参与者。PD-1主要表达于T细胞，其与肿瘤细胞上调的PD-L1或PD-L2的相互作用会抑制T细胞活性，使肿瘤细胞逃避免疫监测和破坏。CAP产生的RONS可能氧化PD-L1/PD-L2等蛋白，从而破坏其与PD-1的结合，增强肿瘤细胞的免疫识别并促进T细胞清除。

为深入研究CAP对ICPs的影响，研究人员采用分子动力学模拟方法，通过氧化配体相互作用位点中的易感残基来模拟不同氧化水平下PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2复合物的情况。研究团队使用GPU加速的GROMACS 5.1软件包进行MD模拟，从蛋白质数据库（PDB）获取了PDB ID为4ZQK和6UMT的PD-L1和PD-L2初始结构。针对每个配体和蛋白质复合物，创建了三组模型系统（2×3=6）：天然PD-L1/PD-L2-PD-1、中度氧化PD-L1^OX1/PD-L2^OX1-PD-1和高度氧化PD-L1^OX2/PD-L2^OX2-PD-1，以模拟短时间和长时间的CAP处理。通过Vienna-PTM 2.0网络服务器修改配体中的特定残基，选择残基的依据是对各种氨基酸（AAs）的溶剂可及表面积（SASA）的计算分析和实验发现。使用GROMOS 54a7力场生成拓扑结构，创建十二面体形状的盒子并进行水合作用，使用SPC水模型和0.1M Na⁺和Cl^-中和系统。能量最小化后，进行NVT系综和NPT系综的平衡模拟，最后进行500 ns的生产运行。

在研究方法上，团队主要运用了分子动力学模拟（MD Simulation）、伞状采样（Umbrella Sampling）、加权直方图分析方法（WHAM）、分子间氢键分析和相互作用指纹分析等关键技术。通过这些计算方法，研究人员能够从原子水平探究氧化作用对蛋白质结构和功能的影响。

RMSD分析显示氧化导致结构失稳

计算研究表明，氧化诱导不同蛋白质类别发生明显的构象变化，改变其结构和功能特性。通过配体原子均方根偏差（RMSD）分析发现，氧化导致两种配体结构失稳。天然结构的PD-L1和PD-L2在整个500 ns模拟中保持最低和最一致的RMSD值。比较两个系统，PD-L2似乎比PD-L1表现出更好的抗氧化性。对于PD-L1，结构偏差是渐进和显著的，OX2状态的RMSD跃升至约0.55 nm的高值。对于PD-L2，虽然氧化也引起结构变化，但偏差幅度不太明显。

RMSD计算表明氧化显著影响配体。PD-L1配体原子的结构波动从天然状态的0.203±0.013 nm急剧增加到OX2状态的0.538±0.018 nm。PD-L2配体也显示出从0.361±0.017 nm到0.514±0.052 nm的显著增加。有趣的是，配体的这些巨大变化对蛋白质复合物的整体稳定性影响较为温和。PD-1/PD-L1复合物保持相对稳定，其骨架RMSD仅从0.462±0.083 nm轻微增加到0.488±0.061 nm。相比之下，PD-1/PD-L2复合物对氧化应激的反应更为明显，其RMSD从0.343±0.034 nm增加到0.433±0.054 nm。这表明配体氧化诱导的结构扰动对PD-1/PD-L2复合物整体结构的失稳影响大于PD-1/PD-L1。

RMSF分析揭示氧化增加残基灵活性

通过残基均方根波动（RMSF）分析进一步清晰展示了氧化效应。随着修饰（即氧化）残基数量的增加，配体变得不稳定，这可能导致通过破坏PD-1与其配体之间的相互作用来破坏肿瘤细胞。在上面的图中，PD-L1/PD-L2配体中氧化形式的氨基酸存在显著波动。例如，将PD-L1中的组氨酸-69修饰为2-氧代组氨酸导致OX1波动增加约0.3 nm，OX2增加约0.25 nm，而天然状态仅为0.15 nm。在PD-L2配体中也观察到类似趋势，其中氧化的失稳效应似乎更加明显。配体的很大区域，特别是跨越残基40-85的环，在修饰后变得显著更灵活。

SASA分析表明氧化增加表面疏水性

对整个蛋白质复合物的溶剂可及表面积（SASA）分析揭示了这些修饰对整体结构紧凑性的影响。随着氧化程度的增加，两个系统的总表面积都呈现明显的渐进增加。对于PD-1/PD-L1复合物，平均SASA从天然状态的约120 nm²增加到高度氧化的OX2状态的约145 nm²。PD-1/PD-L2复合物也观察到类似趋势。氧化修饰可能破坏蛋白质的内部疏水堆积，导致折叠不够紧凑，并增加暴露于溶剂的总体表面积。

PMF分析证实氧化降低结合亲和力

通过伞状采样（US）模拟计算平均力势（PMF），评估氧化对PD-1与其配体（如PD-L1和PD-L2复合物）之间相互作用能的影响。对于PD-1/PD-L1系统，天然状态的计算结合自由能ΔG为-106.8±4.6 kJ/mol。修饰后，该值显著降低至PD-L1^OX1的-53.5±4.3 kJ/mol和PD-L1^OX2的-31.4±2.5 kJ/mol。这表明结合稳定性明显逐渐降低，表明氧化削弱了PD-1/PD-L1相互作用。相比之下，天然PD-1/PD-L2复合物表现出更大的初始稳定性，ΔG_bind为-208.3±5.1 kJ/mol。虽然氧化也将其稳定性降低至PD-L2^OX1的-171.2±4.9 kJ/mol和PD-L2^OX2的-128.9±4.1 kJ/mol，但氧化的PD-L2复合物仍然比其PD-L1对应物显著更稳定。这表明氧化修饰对这些复合物具有差异效应。

研究结论表明，蛋白质氧化可能导致PD-L1和PD-L2发生显著的结构变化，这对它们与PD-1的结合至关重要。这些构象改变导致与PD-1和治疗性抗体的结合亲和力降低，突显了氧化修饰在调节蛋白质功能中的关键作用。这项研究为了解氧化应激如何调节免疫检查点相互作用的分子机制提供了宝贵见解。此类修饰可能作为增强免疫激活的自然机制。理解这些动力学为了解氧化应激在CAP治疗后如何影响免疫调节提供了新视角。

此外，这些发现强调了靶向治疗性干预中氧化途径的潜力，旨在调节免疫检查点活性。例如，通过CAP等治疗利用氧化过程可能提供一种有前景的方法来破坏免疫检查点相互作用并增强癌症治疗中的免疫反应。MD模拟还为未来研究探索受氧化修饰影响的其他免疫相关蛋白铺平了道路。在更广泛的生物学背景中研究这些效应对于将这些发现转化为临床应用至关重要。

该研究由乌兹别克斯坦先进技术中心实验生物物理实验室Rasulbek Mashalov和Zulfizar Toshpulatova、中国深圳先进技术研究所陈志通（Zhitong Chen）以及乌兹别克斯坦TIIAME国立研究大学Jamoliddin Razzokov共同完成，研究成果发表在《Scientific Reports》期刊，为开发新型癌症免疫治疗策略提供了重要的理论基础和分子机制见解。