双光子显微镜扩展模块实现灵活活体成像与全光学生理学研究

本刊推荐：研究人员针对传统双光子显微镜在样本可达性和光遗传学操控方面的局限性，开发了开源低成本扩展模块Ex2p/Ex2pO。该模块通过增加物镜旋转轴和与共振扫描非成像间隔同步的单光子光刺激功能，实现了对弯曲样本的自然姿态成像，并在双光子成像中实现了最小串扰的同时成像与单光子刺激。研究成功在虚拟现实环境行为小鼠和多能干细胞衍生的皮质类器官中演示了全光学生理学 interrogation，为现有双光子成像系统提供了全新的多功能研究平台。

　　

在神经科学研究领域，双光子成像技术已成为揭示活体动物大脑结构和功能的重要手段。然而，传统的双光子显微镜存在明显局限性——它们无法倾斜物镜，导致研究人员不得不改变实验对象的自然姿态来适应成像需求。这种限制在对弯曲组织（如大脑）成像时尤其突出，同时也限制了行为实验装置（包括虚拟现实环境）的集成空间。更令人困扰的是，将光遗传学操控与双光子钙成像结合时，刺激光与荧光信号之间的串扰问题难以解决，而许多商业显微镜缺乏定制化能力来添加刺激光路。

针对这些技术瓶颈，Nagoya大学的研究团队在《iScience》上发表了他们的创新解决方案——Ex2p/Ex2pO扩展模块。这个开源的低成本模块能够在不修改现有显微镜核心结构的情况下，为标准双光子显微镜增加物镜旋转轴和与共振扫描非成像间隔同步的单光子光刺激功能。

研究人员主要运用了机械光学模块设计、共振扫描同步控制、空间光场调控和跨尺度生物系统验证等关键技术方法。实验样本包括Thy1-GCaMP6f转基因小鼠和人类诱导多能干细胞衍生的皮质类器官。

Ex2p扩展现有显微镜的光学可达性

研究团队首先开发了Ex2p模块的机械设计，通过组合两个银镜增加了物镜与显微镜主体之间的工作距离，提供了90.4毫米的行为装置或大型动物（如非人灵长类）空间。物镜倾斜功能通过位于镜片之间的空心旋转台组件实现，可在±0.1°的精度下保持2小时稳定。研究人员在Thy1-GCaMP6f小鼠进行空间导航任务的虚拟现实实验中，使用倾斜约15°的物镜对海马神经元成像，成功记录了右侧背侧CA1区369个活跃神经元的活动，其中85个神经元在跑步机位置显示出响应偏好，这些神经元的响应特性与背侧CA1的典型局部活动模式一致。

开发额外的单光子激发通路

为解决同时进行双光子Ca²⁺成像和光刺激的局限性，研究人员开发了配备光纤输入口的Ex2pO版本。该模块通过在配对银镜之间插入包含窄带激光器和滤波器的单元，并结合陷波二向色镜来增加激发线。为保护探测器免受激发光潜在损伤，在探测器线前安装了长通阻挡滤光片。光学性能测试显示，Ex2pO的最大扫描面积为765×765微米，比标准组件的800×800微米减少了约4%，但这是固定的几何效应而非扫描角依赖性渐晕。激光透过率在扫描区域中心和周边均降低了约13%，但成像性能未受到严重影响。

通过共振扫描同步的时间域复用方法有效解决了串扰问题。研究人员使用砷化镓磷(GaAsP)探测器，即使使用激发光带阻滤波器，激发光与荧光之间仍会发生串扰。通过将刺激激光的峰值功率时间与共振扫描同步，使用基于现场可编程门阵列(FPGA)的多功能仪器进行简单电路修改，实现了微秒级延迟调制而无抖动。在同步条件下，激光刺激对激光关闭区域的像素强度没有影响(＜0.01%)，而在非同步条件下，刺激使任意X位置的ΔF/F增加了3.0%±1.6%。

Ex2pO激发的空间特性

研究发现Ex2pO照明区域可以根据用户需求进行调整以实现所需操作。通过高数值孔径(NA)物镜的照明在焦平面产生更局部化和高效的刺激，但在离焦区域照明面积更大。相反，通过低NA物镜的照明沿光轴提供均匀照明。在过填充条件下，刺激激光完全填充物镜后孔径场，激发光的横向半高宽(FWHM)在焦平面处最小，并随与该平面轴向距离的增加明显加宽。在欠填充条件下(较低NA)，观察到更均匀的轴向轮廓。

用Ex2pO进行神经操控

为评估Ex2pO精确神经操控能力，研究人员将腺相关病毒载体(AAV) AAV1-Ef1a-ChrimsonR-tdTomato注射到Thy1-GCaMP6f小鼠的前内侧皮质视觉区(AM)，其中兴奋性神经元在整个大脑皮层表达GCaMP6f。通过视网膜拓扑映射程序的宽场Ca²⁺成像识别靶点，opsin(视蛋白)表达限制在注射位点附近。对虚拟现实中小鼠的双光子成像显示了注射位点周边表达GCaMP6f和tdTomato的神经元。通过Ex2pO的短暂重复激光刺激(0.1秒持续时间，2.5毫瓦)在AM神经元中引发了可重复的神经响应。

研究还测试了其在人类皮质类器官中的实用性。通过AAV-DJ-hSyn-jGCaMP7f和AAV-DJ-CAG-ChrimsonR-tdTomato病毒载体将jGCaMP7f和ChrimsonR引入类器官，重复激光刺激(0.5秒持续时间，638纳米，10.0毫瓦)在一部分神经元中引发了激光诱发的神经元活动。

后皮质长程输入效应的功能映射

研究人员测试了Ex2pO是否能够映射长程输入对大脑皮层个体神经元响应的影响。开发了带有CAG启动子的AAV构建体以最大化轴突末端中的opsin表达(AAV9-CAG-ChrimsonR-tdTomato)，将病毒立体定向注射到Thy1-GCaMP6f小鼠的前扣带皮层(ACC)，在包括初级视觉皮层(V1)、后内侧皮质视觉区(PM)和压后皮层(RSC)的后皮质区域植入成像窗口。在ACC神经元发送轴突投射的区域成功检测到荧光报告蛋白的表达。

同时进行双光子Ca²⁺成像和单光子激发(0.5秒持续时间，8.0毫瓦)，从950个感兴趣区域(ROI)记录了刺激响应，在刺激期间和之后观察到成像位点中的兴奋和抑制响应。15.9%的记录细胞显示出统计显著响应，所有皮质区域中兴奋的ROI数量超过抑制细胞。阴性对照实验证实观察到的活动变化是由ChrimsonR激活而非光刺激的非特异性效应引起。

研究结论与意义

Ex2p/Ex2pO模块为现有多光子显微镜提供了实现灵活成像和光学操控的开源解决方案。其光学性能、激发效率和时间精度适用于活体动物和类器官的神经生理学研究。该模块大多数组件都是商用产品，研究人员无需修改显微镜核心结构即可组装和实施Ex2pO到他们的实验设置中。

研究增强了现有显微镜的成像灵活性，通过旋转物镜设计提供了更经济紧凑的解决方案。时间域复用方法使用共振扫描转向时间被证明是克服串扰的有效解决方案。刺激光的波长和功率是光遗传学操控目标神经元的关键参数，半导体激光二极管与共振扫描同步实现了高时间精度。

该平台的潜在应用不仅限于光遗传学神经操控，还可 readily 适配于任何需要成像和光刺激的显微镜，或其他光学应用，如使用笼状化合物、光转化蛋白和组织消融的实验。通过简单更换或设计二向色镜、阻挡滤光片和照明，用户可定制满足其特定需求。

Ex2p/Ex2pO模块为升级现有双光子显微镜提供了经济有效的解决方案(约3,000美元，不包括光源)。Ex2p是用户寻求整合行为设置（如虚拟现实）的简单经济选择，Ex2pO具有与Ex2p相同的机械特性，是进行全光学生理学实验的理想选择。其关键优势包括成本效益、对弯曲样本的适应性和低串扰。作为开源工具，Ex2p/Ex2pO还将受益于寻求在物镜前整合外部光路或扩展显微镜下空间以适应更大动物物种（如非人灵长类）的高级用户。