基于微血管芯片与MAGIN动态形态分析揭示周细胞调控新生血管生成的时空异质性

本研究针对传统血管生成研究在三维形态动态量化与细胞互作分析方面的技术瓶颈，开发了结合微血管芯片模型与形态自适应高斯径向基函数迭代非刚性配准（MAGIN）的创新平台。通过时空分析周细胞-内皮细胞互作，揭示了血管芽生过程中生长/退缩区域分异规律，首次发现周细胞接触通过局部Notch信号激活与MMP-1梯度分布促进血管形态成熟。该研究为发育生物学提供了高精度动态分析工具，对治疗性血管生成研究具有重要价值。

　　

血管生成是从已有血管形成新毛细血管的关键过程，在缺血性疾病治疗和肿瘤生长转移中起决定性作用。虽然活体显微镜技术能揭示血管生成的高度动态特性——包括生长（延伸、停滞、分支、内嵌）和重塑（吻合、退缩、修剪）等复杂现象，但种间差异仍阻碍转化研究。传统非侵入性血管成像方法如计算机断层扫描和动态磁共振成像，主要针对大尺度血管重塑，缺乏解析人体内微血管事件的空间分辨率。近年来，微生理系统（MPSs）作为潜在体外实验平台受到关注，其中模拟体内微血管结构的模型为研究人员提供了便捷平台，可用于分子运输、血管屏障功能表征或实时观察血管生成动力学。尽管体外微血管模型在样本通量和培养条件控制方面更具自由度，但高质量图像数据与高分辨率分析之间仍存在障碍。现有研究通常提取血管中心线进行形态分析，但主要关注构建血管网络各节段间的大尺度形态和拓扑结构，而 nascent angiogenesis 的动态过程复杂，延伸、收缩、扩张、退缩和细胞位置移动导致区域异质性，传统方法难以捕捉。

为此，研究人员在《Cell Biomaterials》发表研究，通过开发层次化配准方法结合局部形态和网格生长，直观映射形状变化并定量评估血管生成动力学。利用周细胞-内皮细胞工程化微血管模型，时空测量揭示：（1）母体血管和血管芽上不同的变形模式和生长/退缩分区；（2）周细胞定位和覆盖的时空变化；（3）周细胞-微血管接触通过局部Notch激活、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）分布、血管生成动力学异质性和形态成熟增强效应。该平台能全面表征血管生成过程中的共培养效应，支持多模态数据集交互融合用于未来血管形态发生研究。

研究采用几个关键技术方法：首先构建周细胞-内皮细胞共培养微血管芯片模型，使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和周细胞混合胶原凝胶，通过离心将周细胞与2.4 mg/mL胶原I凝胶混合至5×10⁶ cells/mL浓度；其次采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获取时间序列z-stack三维图像，通过IMARIS软件重建表面网格；最后开发形态自适应高斯径向基函数（GRBF）迭代非刚性配准（MAGIN）方法进行三维网格配准和顶点对应搜索，整合父血管-芽生分割、局部精细网格变形和新顶点插值算法，实现大长宽比血管变形的精准量化。

微血管模型重现血管生成形态发生过程

通过ECs和周细胞混合胶原凝胶制备微血管芯片，显微镜图像显示从第1天到第5天显著血管扩张和周细胞定向迁移。至第5天，观察到血管芽（白色箭头）和两个芽融合形成的环状结构（白色箭头头），证明模型成功模拟再生细胞植入后的血管生成过程。

MAGIN配准为时间序列网格提供良好对齐以实现对应匹配

通过迭代配准和网格生长模拟自然血管生成动力学，将整体出芽运动离散为单个顶点位移的集合，从而实现时间序列网格跟踪和高分辨率血管生成动力学量化。结果显示MAGIN方法在处理曲线结构和不规则变形方面优于刚性配准和传统GRBF配准，Hausdorff距离和Chamfer距离定量比较证明MAGIN方法在处理多尺度血管变形方面的优越性。

血管芽上的局部生长/退缩分类和动力学类型分区：生长在尖端区域，退缩在根区

根据时间序列数据中的对应关系定义局部退缩和生长状态，并分析其空间分布。假设顶点法线方向为每个顶点的生长方向，计算顶点法线与变形向量之间的角度以测量局部生长和退缩。结果显示，芽生顶点组中生长区（0°<>

周细胞选择性迁移至芽生区域，增加芽生异质性，并通过Notch和MMP-1调节促进芽生形态成熟

将周细胞覆盖状态与父血管-芽生分类标签、顶点变形信息和特定芽形态的时间变化整合，揭示周细胞滞留和周细胞-微血管串扰的时空动力学。定量分析显示，周细胞覆盖顶点比例从第3天的8.16%略微增加至第5天的10.2%，芽生顶点在总周细胞覆盖顶点中的比例从第3天的14.5%逐步增加至第5天的22.8%。周细胞覆盖状态的保留率在芽生区域（第3-4天22.4%，第4-5天32.9%）高于父血管水平（第3-4天22.3%，第4-5天28.9%），表明周细胞更倾向于留在芽生区域。

周细胞覆盖顶点的变形距离更集中于小变形区域（0-10μm），而周细胞未覆盖顶点的分布更均匀且在较大变形区域（10-40μm）份额更大。周细胞覆盖条件下生长区比例相对更大，表明周细胞覆盖促进血管表面生长。进一步整合父血管-芽生分类信息显示，周细胞覆盖和未覆盖的芽生顶点均呈现生长/退缩分区，但周细胞覆盖条件下的分布差异（ECDFs最大绝对差0.351；TVD 0.400）比未覆盖条件（ECDFs最大绝对差0.166；TVD 0.165）更明显。

为用生物学证据验证局部动态分区并量化周细胞效应，研究人员可视化Notch信号激活标志物Notch-1胞内域（N1ICD）和血管退缩相关标志物MMP-1在芽生上的表达。结果显示，周细胞-EC共培养芯片比EC单独培养芯片具有更高的N1ICD和MMP-1表达水平。空间上，共培养芽生上N1ICD和MMP-1表达水平沿芽生异质分布，高表达区域集中在根区；而单独培养芯片芽生上N1ICD和MMP-1水平均匀分布。沿芽生边界从根到尖的荧光强度测量显示，共培养芽生上N1ICD和MMP-1表达水平从根到尖急剧下降，而单独培养芽生上均匀分布且向尖部略有下降。

周细胞覆盖对单个芽生形态的定量分析

选择观察期间未经历退缩或融合的芽生，检查其周细胞覆盖状态，并追踪时间高斯曲率标准差（SD）和芽生长度变化。高斯曲率SD作为整体表面光滑度的几何指标，高值表示强烈曲率变化和粗糙表面。结果显示，周细胞覆盖芽生的高斯曲率SD中位数随时间普遍降低（前一天：1.79×10^-3，后一天：1.58×10^-3，单位：μm^-2）。周细胞未覆盖芽生的高斯曲率SD中位数（前一天：1.87×10^-3；后一天：1.61×10^-3；单位：μm^-2）高于周细胞覆盖芽生，但差异无统计学意义。将表面网格在其主成分分析（PCA）第一轴上的投影定义为芽生长度，比较显示两组随时间均实现芽生伸长，但周细胞覆盖芽生长度中位数（前一天74.8μm，后一天77.0μm）始终大于未覆盖芽生（前一天51.1μm，后一天52.7μm）。

研究结论与讨论部分强调，该研究通过构建3D周细胞-微血管共培养系统并提出MAGIN方法进行体外血管生成研究，定量测量了周细胞覆盖对微血管局部动力学和新生芽成熟过程的影响。时间序列三维网格的数值测量为血管生成研究提供了新视角，周细胞接触诱导的异质化和芽生根区退缩是首次发现，揭示了一部分综合形态发生过程并验证了MAGIN方法的准确性。

血管生成作为血管新生的关键过程，芽生区域比父血管区域具有更大的平均变形距离，大多数芽生顶点经历局部生长，这与体内血管生成研究中静态母体血管和活跃血管芽的发现一致。当进一步分析变形状态的空间分布时，发现许多芽生在根侧出现局部退缩，这与之前观察到的周细胞附着热点区域一致。根区是芽生与母体血管的连接处，适当的根区和近端区域直径确保了尖端细胞域、新生血管区和母体血管之间的连接性和灌注性，而钝端芽生和过大的近端区域将导致最终血管化和灌注性的显著缺陷。

周细胞迁移和滞留的定量分析表明，周细胞感知局部环境并选择性选择芽生，而不是在凝胶中随机浮动。周细胞覆盖状态保留率低于50%表明周细胞倾向于随时间改变位置，但芽生顶点上周细胞的更大保留表明一旦定居，周细胞更可能留在芽生上，间接证明了趋向性和周细胞-EC串扰的存在。

在单个顶点水平、芽生区域水平和整个芽生水平系统评估周细胞影响表明，周细胞覆盖顶点呈现独特的局部变形特征和位移减小且生长率升高。变形距离减小反映了周细胞介导的EC连接增强和血管屏障稳定，生长率升高表明周细胞可启动芽生形成。整合局部几何信息揭示周细胞覆盖和未覆盖芽生之间生长和退缩状态的分布存在明显分歧，表明直接周细胞-EC接触触发导致异质血管生成动力学的信号通路。

Notch信号通路激活标志物N1ICD对血管生成引导、血管稳定、周细胞-EC相互作用和血管直径调节至关重要。与之前周细胞覆盖介导EC Notch信号激活的报道一致，研究发现周细胞覆盖的根区局部Notch激活，而无周细胞覆盖的芽生上Notch激活区域更均匀分布。MMP-1是血管动力学的双面调节因子：其蛋白水解活性介导胶原降解、基质支架分解、血管结构退缩和血管收缩；同时，MMP-1还通过ECM重塑和VEGF受体-2上调驱动微血管生成，该受体在芽生尖端细胞中高表达。通过映射MMP-1表达，发现共培养芽生上非均匀分布特征——根部分表达峰值、中央信号最小和尖部适度上升，中央抑制与之前报道的周细胞介导MMP-1抑制一致，并通过与单独培养芽生相比MMP-1荧光强度整体降低得到进一步支持。有趣的是，MMP-1表达升高区域（尖部和根部）与周细胞优先定居位置一致，表明周细胞-EC串扰模式由局部形态空间调谐。

最后，周细胞覆盖和未覆盖芽生的全局形态变化比较表明，虽然两组均呈现表面光滑度和伸长逐渐增加，但周细胞覆盖芽生始终比未覆盖芽生具有更大的表面光滑度和长度。这些发现进一步支持周细胞-EC接触增强芽生成熟的假设，且这种效应可能无法仅通过长距离细胞-细胞串扰替代。

该研究开发的MAGIN方法为血管生成测量提供了创新工具，未来可通过更快的光场三维成像技术验证其在更大批次和更长观察期的可行性。预计将开发用于复杂血管结构分析的适配方法，如类器官中的血管网络、斑马鱼血管化、兔耳伤口愈合血管生成和三层层状视网膜血管生成，并通过本征图方法在网格变形前推断对应关系。还将考虑复杂串扰机制，如远距离相互作用的分泌因子（旁分泌）或直接接触相互作用的膜蛋白（近分泌）。