蜂王越冬储存（Apis mellifera）对其生理品质及蜂群性能的影响研究

本综述深入探讨了蜂王（Apis mellifera）在蜂群中越冬储存（queen banking）对其营养状态（如血淋巴总蛋白和卵黄原蛋白Vg水平）、繁殖生理（如卵巢重量、精子数量和存活率）及蜂群性能（育雏量、蜂群增重）的全面影响。研究证实，尽管储存蜂王越冬存活率存在波动，但其关键生理参数与对照组无显著差异，且春季引入蜂群后长期表现相当。该策略为减少蜂王进口依赖、提升自给能力提供了重要理论与实践依据，尤其适用于加拿大等北方气候地区养蜂业。

　　

引言

加拿大养蜂业在很大程度上依赖于从其他国家进口蜂王，因为其北方气候对蜂王培育构成了挑战。蜂群的繁殖周期始于能够获取产生花粉和花蜜的开花资源，这些资源对于培育新蜂王和成熟雄蜂至关重要。产业对蜂王的需求在早春达到高峰，但与本地供应不同步，从而减少了养蜂人更换死亡蜂王或增加蜂群数量的机会。进口蜜蜂带来了显著风险，包括引入不适宜的遗传品系、抗生素耐药性病原体、寄生虫（如小蜂甲虫Aethina tumida）、抗治疗的狄斯瓦螨Varroa destructor以及非洲化蜜蜂。

为了减轻进口风险并提高加拿大在蜂王供应方面的自给自足能力，近年来探索了替代方法。最近的研究集中在评估冬季储存蜂王（蜂王银行）的可行性，目的是确保它们在次年早春可用。研究已经确定了成功冬季储存蜂王银行的关键因素，包括在引入蜂王前24至48小时使宿主蜂群成为无王群，确保宿主蜂群强壮、无病且拥有大量年轻的哺育蜂，选择外界温度最小化蜂群结团的时间进行操作，提供充足的营养储备，以及将蜂王单独保存在笼中。尽管先前的研究报告了蜂王的平均存活率存在变异，但最近的试验显示了令人鼓舞的结果。

更深入地检查某些生理、繁殖和营养参数对于加深当前对成功冬季蜂王储存的认识至关重要。许多这些特征与蛋白质和卵黄原蛋白（Vg）在蜜蜂蜂群生活中的关键作用有关。卵黄原蛋白是一种在腹部脂肪体中合成的磷脂糖蛋白，释放到血淋巴中，并作为各种器官的能量储备。在新出房的蜂王中，它可以占到血淋巴总蛋白的70%，并在成年期一直存在。卵黄原蛋白在社会个体发育中扮演关键角色，包括产卵、育雏、工蜂觅食、昼夜节律、免疫系统发育、蜂王繁殖和寿命。此外，它是锌的主要载体，对免疫系统至关重要。

本研究旨在解决关于越冬蜂王储存对蜂王营养和繁殖生理品质以及其在蜂群中整体表现的影响的知识空白。研究在2020年10月至2021年4月期间进行，在此期间，蜂王在常规蜂群或储存蜂群中越冬。随后评估并比较了它们的繁殖和营养质量，以及它们在2021年养蜂季节在蜂群中的表现。我们的假设是，在常规蜂群中越冬的蜂王与在储存蜂群中越冬的蜂王之间没有显著差异。

材料与方法

蜂王储存

2020年8月底，从参与养蜂人（Rayon de miel, QC, Canada）的蜂群中选择了16个蜂群（Langstroth标准设备）。这些蜂群在8月底接受了瓦螨处理，包括在蜂箱底板上三次施用65%液态甲酸，以及使用Fumagilin-B治疗微孢子虫Vairimorpha ssp.。9月8日，移除蜂王，并将蜂群合并，创建了8个双育雏箱的无王蜂群，每个至少包含16框育雏和蜜蜂。这种合并旨在创建非常强壮的蜂群，充满年轻的蜜蜂。这些年轻的蜜蜂对于照顾将在每个储存群中越冬的40只新交配蜂王至关重要。通过在被合并的箱体之间放置一张轻微刺破的报纸来限制攻击性。第二天，将40只单独笼养的蜂王（California Mini Queen Cages, Mann Lake Ltd.）放置在一个支撑框上，并插入顶箱的中央。选择40只蜂王是基于先前的研究，表明超过40只蜂王会导致春季死亡蜂王的百分比更高。从9月10日到9月30日，使用“Miller”饲喂器给蜂群饲喂32升2:1的蔗糖糖浆（w/w），确保整个冬季有足够的营养储备。10月26日，根据先前的研究，将这些蜂群及其蜂王储存群放入一个越冬室（15 °C ± 0.5 °C；相对湿度：未控制）。从11月到4月，所有蜂群都配备了一个入口饲喂器，并接受3升2:1的蔗糖糖浆。

对照蜂王

2020年8月15日，从具有相似遗传背景的蜂群中创建了75个核群。每个核群包含大约两框封盖育雏附带年轻蜜蜂、一框花粉和一框蜂蜜，全部放置在一个包含六框的改良Langstroth木制蜂箱中。将新交配的蜂王引入每个核群。7天后，66个蜂群有产卵王，这些被指定为对照蜂王。从9月10日到9月30日，使用倒置的桶式饲喂器给它们饲喂16升2:1的糖浆。10月26日，将这些蜂群转移到越冬室（5 °C ± 1 °C；相对湿度：未控制）。2021年3月21日，将蜂群从越冬室移出，放置在场地户外（QC, Canada），并用保温箔包裹以保护免受寒冷春季温度的影响。

蜂王繁殖和营养质量评估

对储存蜂王和对照蜂群的蜂王进行了三次评估。在9月任何干预开始之前，对10只蜂王样本进行了包含所有相关参数的全面评估。该评估旨在为后续研究过程中的比较和评估建立基础参考。随后的蜂王取样和评估在实验开始时的9月10日（T0 = 第0天）、进入越冬室前的10月22日（T42 = 第42天）和越冬后的5月1日（T233 = 第233天）进行。所有取样的蜂王通过冰上低温麻醉处死，并进行以下操作和测量：

蜂王存活率：通过现场打开蜂群评估蜂王死亡率。蜂王的存在表明其存活。相反，蜂王缺失，且没有卵和育雏，则将其归类为死亡。

解剖学测量：测量重量（天平Model KHA 203, Kilotech Inc.）、腹部长度和宽度（电子卡尺Model 93882, Mitutoyo SR44）。通过长度乘以宽度计算腹部指数。

血淋巴收集：通过在第三和第四背板之间的腹部壁上的一个小中央切口，使用10 μl毛细管收集血淋巴。将毛细管填充至10 μl，然后立即将内容物转移到一个聚丙烯管中，并放在干冰上，直至转移到设定为-80 °C的冷冻室中储存，以备将来分析。

繁殖品质：通过低温麻醉处死蜂王并解剖，取出受精囊和两个卵巢。一起称重卵巢。将受精囊放入一个含有1 mL改良Kiev缓冲液的聚丙烯管中，并用小镊子轻轻撕开，将精子释放到溶液中。然后使用涡旋振荡器在低速下混合20秒。受精囊精子数量量化为每微升精子数（N/μl），并根据Rousseau等人概述的方法评估受精囊活力，以活精子百分比表示。

血淋巴蛋白含量：用提取的10 μl血淋巴制备溶液，并向其中加入60 μl血淋巴缓冲液。使用 bicinchoninic acid (BCA) 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，并根据制造商的方案确定标准曲线。然后使用BCA测试获得的总蛋白结果计算进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所需的样品（血淋巴溶液）体积。每个样品通过加入12.5 μl 4x LDS + 6% ?-巯基乙醇并用水调整总体积至50 μl来稀释至1μg总蛋白/μl溶液。然后将溶液在95 °C加热5分钟，每孔上样20 μl变性的总蛋白溶液，并在120 mA下进行电泳2小时30分钟。用于电泳的凝胶由0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）和7.5%聚丙烯酰胺分离胶以及顶部的4%聚丙烯酰胺堆积胶组成，能够分离30 kDa至200 kDa范围内的蛋白质。

血淋巴卵黄原蛋白水平：根据Christen等人的方案（略有修改）制备免疫印迹。电泳完成后，将凝胶根据制造商的规格（OWL VEP-3 Electroblotting tank, Thermo Fisher Scientific, USA）放入转移槽的卡匣中。在聚偏二氟乙烯膜上的转移设定为140 mA，持续6小时。转移后，用Ponceau S对膜进行染色以绘制蛋白质图谱，并使用BLUeye Prestained Protein Ladder作为标记。然后洗涤膜以去除Ponceau S染色，并根据制造商的方案（略有修改）对PVDF膜进行AzureRed荧光蛋白染色。膜没有按照说明干燥，而是进一步处理进行免疫印迹。对于免疫印迹，使用针对蜜蜂卵黄原蛋白特异性肽抗体（如Christen等人所述），由Pacific Immunology生产。将PVDF膜在含有AzureRed封闭缓冲液和以1:4000稀释的抗卵黄原蛋白多克隆抗体的溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1小时。孵育后，用PBS-T洗涤膜三次，然后在室温下在以1:10,000稀释在AzureRed封闭缓冲液中的二抗溶液（AzureSpectra goat-anti-rabbit IgG IR800）中再孵育1小时。随后，再次用PBS-T洗涤三次以去除任何未结合的抗体，并在800 nm获取卵黄原蛋白特异性信号。此外，使用Azure 500Q成像系统的Cy3通道获取总蛋白。使用GelAnalyzer 19.1软件对检测到的荧光信号进行量化。结果使用总蛋白标准化进行标准化，即目标蛋白（条带）的丰度标准化为每个泳道中的总蛋白量。

储存越冬存活蜂王在蜂群中的表现

2021年4月25日，使用上述方法创建了30个核群。从越冬储存群中随机选择存活的蜂王，将它们从各自的保持笼中取出，放入新的California Mini笼中，然后引入核群。6天后，27只蜂王开始产卵。同样在2021年4月25日，从28个单独越冬一只蜂王的对照蜂群上移除了保温箔。所有这些蜂群于2021年5月12日从它们的6框Langstroth蜂箱转移到10框Langstroth蜂箱中。5月14日，总共55个蜂群被随机分布在两个蜂场（Jonathan, QC, Canada; Antoine, QC, Canada），在那里它们为蜂蜜生产进行管理，并在8月底前四次评估了以下性能变量：

蜂群强度：计算蜂箱每个箱体中至少有90%工蜂覆盖的巢框数量，以获得有蜜蜂的总框数。

育雏数量：通过测量每个育雏框两侧未成熟工蜂（卵 + 幼虫 + 封盖育雏）所占表面的宽度和长度来评估蜂群中的育雏面积。然后将宽度和长度相乘得到一个矩形面积。得到的总育雏面积然后乘以0.8以考虑育雏的椭圆形。在测量过程中，还通过将封盖育雏面积除以总育雏面积并将结果乘以100来获得封盖育雏的百分比。

增重：通过用台秤称量每个蜂群来评估总增重。

统计分析

所有统计分析均使用R软件（版本4.4.3）在0.05显著性水平下进行。对于每个模型，使用Shapiro-Wilk统计量对残差验证正态性假设。当残差偏离正态性时，使用Box-Cox技术来识别响应变量的适当变换。例如，对蜂王重量、精子数量和总蛋白浓度使用平方根变换，对精子活力使用平方变换，对标准化相对卵黄原蛋白强度使用对数变换。蜂群性能指标（蜜蜂框数、育雏面积和增重）不需要变换。对于所有涉及响应变量变换的模型，边际均值总是估计回其原始尺度。在模型中出现任何显著效应后，使用成对比较和预先计划的对比（emmeans包中的emmeans和contrast函数）来评估处理差异。

为了比较对照和储存蜂王（将每只蜂王视为一个生物学重复）的体重、卵巢重量、腹部指数、精子数量、精子活力和总蛋白水平，我们使用了广义最小二乘模型（GLS；nlme包中的gls函数），因为没有需要考虑的随机效应。对于每个响应变量，考虑了一个具有同方差性的模型和另一个具有异方差性的模型。根据Akaike信息准则（AIC）选择最拟合数据的模型。

使用线性混合模型（LME；nlme库中的lme函数）比较对照和储存蜂王（处理）之间的血淋巴卵黄原蛋白水平（标准化至9月基线）。因此，处理效应是模型的固定部分。在模型的随机部分，我们考虑了“泳道”和/或“膜”的效应。最终模型仅考虑“泳道”效应，因为根据AIC准则，该模型最拟合数据。

为了在任何日期比较对照和储存蜂群（处理）之间的蜂群性能参数（包括覆盖蜜蜂的框数、育雏面积和增重），我们使用了线性混合效应模型（LME；nlme包中的lme函数）。处理和日期效应以及它们的交互作用是这些模型的固定部分，而嵌套在蜂场中的蜂箱是随机效应。对于每个响应变量，考虑了在同一蜂箱上跨时间观察的不同相关结构，以及不同形式的异方差性。根据AIC准则选择最拟合数据的模型。

如果发生蜂王损失、更换或分蜂，则将蜂群归类为死亡，因为由此产生的蜂群状态（例如，存在处女王或新交配王）不再反映原始处理。这种分类确保存活结果反映了最初引入蜂王的命运，从而保持了处理比较的生物学有效性。使用二项广义线性混合模型（GLMM；lme4包中的glmer函数）分析蜂群存活率（二分类：存活 vs. 死亡）。同样，处理（对照和储存蜂群）和日期效应以及它们的交互作用是模型的固定部分，而嵌套在蜂场中的蜂箱是随机效应。

结果

从2020年10月26日到2021年5月1日，储存蜂王的冬季存活率为37 ± 9%（平均值 ± 标准误），而单独在蜂群中越冬的对照蜂王的平均存活率较高，为89%。不同蜂王储存群之间的存活率存在重要范围，百分比在11%到70%之间变化。

蜂王繁殖和营养质量评估

越冬前，储存蜂王（BQ; 0.191 g）显著轻于对照蜂王（CQ; 0.219 g），但越冬后未发现统计学显著差异（BQ; 0.202 g vs. CQ; 0.200 g）。

越冬前，对照蜂王（CQ; 0.049 g）的卵巢重量显著大于储存蜂王（BQ; 0.032 g）。越冬后，组间卵巢重量相似（CQ; 0.046 g vs. BQ; 0.042 g）。

越冬前精子数量相似（CQ; 6.33 × 10⁶ vs. BQ; 7.52 × 10⁶），越冬后仍具有可比性（CQ; 6.95 × 10⁶ vs. BQ; 7.68 × 10⁶）。

越冬前的平均活精子百分比相似（CQ; 85.9% vs. BQ; 80.5%），越冬后活力仍具有可比性（CQ; 81.6% vs. BQ; 81.8%）。

越冬前，储存蜂王的血淋巴蛋白水平（BQ; 9.9 μg/μl）显著低于对照蜂王（CQ; 13.0 μg/μl）。然而，越冬后未观察到显著差异（BQ; 7.2 μg/μl vs. CQ; 6.1 μg/μl）。

越冬前或越冬后，对照和储存蜂王之间的卵黄原蛋白水平无显著差异。

蜂王在蜂群中的表现

2021年5月19日引入两个蜂场后，拥有储存蜂王的蜂群具有显著更少的蜜蜂框数（BQ; 3.0 vs. CQ; 3.8）和更小的育雏面积（BQ; 1624.6 cm² vs. CQ; 2169.4 cm²）。

6月16日，拥有储存蜂王的蜂群继续拥有更少的蜜蜂框数（BQ; 12.3 vs. CQ; 14.5），但育雏面积保持相似（BQ; 3057.3 cm² vs. CQ; 3136.9 cm²）。蜂群增重为负值且两组相似（BQ; -2.0 kg vs. CQ; -2.9 kg）。

7月21日，两组的蜜蜂框数（BQ; 16.0 vs. CQ; 17.9）、育雏面积（BQ; 2612.2 cm² vs. CQ; 2587.1 cm²）和蜂群增重（BQ; 21.2 kg vs. CQ; 21.9 kg）相似。

8月18日，蜜蜂框数（BQ; 19.7 vs. CQ; 21.7）和增重（BQ; 21.8 kg vs. CQ; 25.3 kg）保持相似，但储存蜂王的育雏面积显著低于对照蜂群（BQ; 2318.6 cm² vs. CQ; 2805.7 cm²）。

蜂群存活率

2021年5月19日，两组的所有蜂群都存活。到6月16日，两个拥有储存蜂王的蜂群损失，而所有对照蜂群保持完整。到7月21日，两组的存活率进一步下降。到8月18日，对照蜂群的存活率在数值上更高，但差异无统计学意义。

讨论

我们的研究旨在调查越冬储存蜂王对其营养和繁殖生理参数以及在蜂群中整体表现的影响，并与单独越冬的对照蜂王进行比较。通过比较这些参数，我们旨在确定储存蜂王是否在整个冬季保持其繁殖质量和生理参数，与对照蜂王相似。我们评估了诸如体重、卵巢重量、腹部指数、精子数量、活精子百分比、血淋巴蛋白含量和卵黄原蛋白水平等参数，均在越冬前后进行。我们的结果显示，越冬后储存蜂王和对照蜂王在这些参数上没有显著差异。尽管储存蜂王在冬季的平均存活率低于对照蜂王，但不同蜂王储存群中的蜂王存活率存在显著范围。

由于卵黄原蛋白与蜂王营养状况密切相关，我们的研究测量了其从2020年9月到2021年5月在储存蜂王血淋巴中的浓度变化。结果显示，在越冬前后，储存蜂王和对照蜂王之间的相对卵黄原蛋白量没有显著差异。卵黄原蛋白可占蜂王血淋巴总蛋白的70%，并且这种高百分比可能持续其整个生命周期。图4似乎显示了一个趋势，表明在T42时，两组的血淋巴总蛋白浓度相对于其他时间点有所升高。这可以通过卵黄原蛋白和蛋白质的积累来解释，这确保了高能量的身体脂蛋白储备以越冬。然而，储存蜂王组的这种增加显著较低，可能表明存在营养缺陷，很可能与哺育工蜂的营养照料较少有关。这也可能与产卵中断有关，因为卵母细胞对卵黄原蛋白的摄取实际上受营养调节，可能导致激素和蛋白质变化。这可以解释在储存蜂王中观察到的死亡率增加。工蜂在向蜂王提供这些营养素方面发挥着至关重要的作用，从而确保其健康和长寿。我们在这方面的发现凸显了确保向宿主蜂群提供补充蛋白质营养的重要性。蜂群获得良好花粉或其他富含蛋白质的食物反映在血淋巴中高水平的蛋白质和卵黄原蛋白上。这反过来又导致蜂王浆产量增加，蜂王浆是蜂王的主要饮食。摄入富含蛋白质的食物也有助于蜂王和工蜂的长寿。此外，这些考虑表明需要彻底调查先前减弱或发育不良的工蜂世代对当前越冬蜂世代的影响。任何蛋白质或脂质的短缺都可能对工蜂健康产生负面影响，随后降低蜂王饮食质量，并增加蜂王储存失败的风险。越冬后，在T233时，两组的血淋巴总蛋白与初始值（T0）相似，并且储存蜂王和对照蜂王的总蛋白没有显著差异。这表明冬季这些营养储备的代谢利用相似。此外，在宿主蜂群中拥有40只储存蜂王加剧了工蜂的营养需求，增加了对营养良好的哺育蜂的需求，以确保蜂王获得充足的营养。Levesque等人的最近研究表明，80只蜂王储存群的蜂王存活率显著低于40只蜂王的储存群。这再次表明，对储存蜂王的哺育照料值得进一步研究。

获得优质食物对于确保最佳的卵巢形态很重要。Aamidor等人表明，笼养在蜂群中的蜂王的卵子发生是由新鲜花粉的可用性结合变化的日长触发的。我们的研究结果显示，在T42时，储存蜂王的卵巢重量显著低于对照蜂王。这个结果并不令人惊讶，因为笼养蜂王的产卵中断，而对照蜂王则没有。先前关于笼养储存蜂王的研究获得了类似的结果。许多研究表明，卵巢尺寸减小是暂时的，不会损害蜂王质量。我们的工作证实了这一点，因为春季组间卵巢重量相似，并且与T0测量的初始重量相当。

在9月10日的初始取样与随后的两个取样日期之间观察到了精子数量的减少。精子数量的这种下降可能是产卵受精主动利用精子和随时间精子死亡共同作用的结果。然而，尽管存在这种减少，但在越冬前（T42）和越冬后（T233），对照和储存蜂王的精子数量和活力被发现相似（无统计学差异）。这表明，如果越冬后引入蜂群，储存蜂王具有与对照蜂王相同的繁殖成功潜力。总体而言，这些发现进一步支持了使用储存蜂王作为养蜂人的可行选择，这与最近的其他发现一致。

越冬后，将储存蜂王引入蜂群，并与对照蜂王同时监测以测量其性能。我们的研究显示，在第一个月，拥有储存蜂王的蜂群比对照蜂王显著更少的育雏。这可以通过越冬期间卵巢收缩来解释，先前已被证明。此外，蜂王的体重和卵巢重量经常被发现是相关的。Levesque等人的结果显示，引入储存蜂王到蜂群12天后，它们的育雏数量低于对照蜂王。与储存过程本身相关的几个因素可能导致了育雏生产的减少。营养剥夺的生理压力、储存期间温度和湿度的变化以及与工蜂常规互动的隔离可能对蜂王健康和繁殖性能产生负面影响。在 confined 的储存环境中缺乏定期信息素交流和行为干扰也可能改变蜂王的产卵能力。此外，储存过程的压力可能导致暂时的激素失衡并削弱蜂王的免疫反应。然而，我们的结果以及其他类似研究均未显示在夏季后期储存蜂王和对照蜂王在育雏生产、蜜蜂框数或蜂群增重方面存在任何差异。值得注意的是，并非所有蜂群在第一个月（6月）都增加了重量。这可以通过寒冷的天气条件以及蜜蜂和育雏数量的显著增加来解释，这不可避免地导致蜂群储备的更高消耗。这在其他春季蜂群发展的研究中也有观察到。储存蜂王在夏末比对照蜂王产生更少的育雏。在仔细检查我们的数据后，在此时期检测到三个异常蜂群，这解释了这种差异。这些功能失调的蜂群疑似因蜂王性能不佳而崩溃。由于我们的结果显示储存蜂王和对照蜂王之间的生理品质相似，我们怀疑蜂场外部因素的负面影响或存在其他未测量的对蜂王长期存活有害的生理变量。Woyke解释说，当多只蜂王储存在同一蜂群中时，工蜂会伤害蜂王。伤害通常在腿部，并降低蜂王的长期存活和性能。一项基本的预防措施涉及选择用于储存蜂王的笼子筛网的正确孔径大小。研究表明，最大孔径为1.2 mm仅导致7%的蜂王受伤，而孔径为2.5 mm时，67%的蜂王被工蜂伤害。需要进一步研究来测试不同的筛网孔径和笼子尺寸，并调查它们对蜂王伤害的影响。

总结来说，本研究旨在评估冬季储存蜂王的繁殖和营养生理学。结果显示，越冬后，尽管不同宿主蜂群内的存活率存在差异，但储存蜂王和对照蜂王在测量的参数上相似。这些存活率可能受血淋巴卵黄原蛋白和总蛋白水平的影响，因为储存蜂王在秋季水平显著较低，导致冬季死亡概率更高。这凸显了为宿主蜂群提供充足蛋白质饮食以最大化蜂王存活率的重要性。此外，蜂群性能评估显示，两组存活的蜂王在季节期间具有相似的增重。该研究还比较了两组蜂王之间的育雏生产和蜜蜂框数，表明这些参数的变化可能受卵巢重量、蜂箱外部因素或其他未测量变量的影响。为了充分理解这些动态，需要进一步研究评估蜂王的激素变化、卵巢大小以及蜂王在蜂群中多年表现。此类研究有助于确定观察到的统计学显著差异是否对蜂王健康和蜂群成功具有长期影响。尽管需要进一步研究来改进越冬蜂王储存技术，但本研究强调了其在增强养蜂业自给自足能力方面的潜力。

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