非极性氨基酸侧链堆积并非跨膜螺旋二聚化的主要驱动力：大规模设计与实验验证

为解决跨膜螺旋二聚化中非极性氨基酸堆积与范德华力的作用争议，研究人员通过高通量蛋白质设计，构建了数百种仅依赖侧链堆积的TM螺旋二聚体，并利用TOXGREEN sort-seq技术进行实验验证。结果表明，仅靠非极性侧链堆积不足以驱动稳定的二聚化，而含有弱氢键的GASright motif则表现出显著二聚倾向。该研究揭示了膜蛋白折叠中相互作用的能量学本质，对理解膜蛋白结构与功能具有重要意义。

　　

在细胞的生命活动中，膜蛋白发挥着至关重要的作用，它们参与信号转导、物质运输、催化反应等多种关键生物学过程。然而，膜蛋白如何在疏水的脂质双层中正确折叠并形成稳定的三维结构，至今仍是科学家们深入探索的难题。经典的“两阶段模型”（Two-Stage Model）认为，膜蛋白的折叠首先依赖于疏水效应驱动跨膜螺旋（Transmembrane Helix, TM Helix）插入脂质膜（第一阶段），随后这些螺旋再通过相互聚集形成最终的功能结构（第二阶段）。由于疏水效应在第一阶段已基本消耗完毕，第二阶段螺旋间的聚集究竟由何种分子作用力驱动，便成为了理解膜蛋白折叠的关键。

在螺旋-螺旋的相互作用中，极性相互作用（如氢键、静电相互作用）因其在疏水环境中能量上更为有利而备受关注。然而，对天然膜蛋白结构的统计分析发现，其跨膜区氨基酸组成以非极性疏水残基为主，极性残基较少。即便是常见的丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr），其侧链羟基也倾向于与自身主链形成氢键，而非参与螺旋间的相互作用。这意味着，许多天然的跨膜螺旋二聚体界面实际上是由非极性氨基酸侧链的紧密堆积（Packing）和由此产生的范德华力（van der Waals, vdW）所介导的。一个核心问题随之产生：仅靠非极性侧链的堆积和范德华相互作用，是否足以成为驱动跨膜螺旋发生二聚的强大力量？

此前的研究表明，紧密的侧链堆积对于膜蛋白的稳定性是必需的，破坏堆积（如产生空腔或立体碰撞）会显著 destabilize 蛋白质结构。更有研究成功设计出了仅由非极性氨基酸组成、完全依赖侧链堆积便可稳定存在的五聚体膜蛋白（如磷酸受纳蛋白 pentamer），证明其在某些高度优化的特定情况下是可行的。但这究竟是普遍规律，还是特例？为了回答这个问题，来自威斯康星大学麦迪逊分校的 Gilbert J. Loiseau 和 Alessandro Senes 教授在《Biophysical Journal》上发表了一项大规模的研究。他们采用了高通量的蛋白质设计策略，系统地评估了在多种常见螺旋-螺旋构象中，仅由非极性氨基酸堆积驱动的二聚体的稳定性。

为开展本研究，作者团队运用了几个关键技术方法：1) 从OPM（Orientations of Proteins in Membranes）数据库提取非冗余膜蛋白结构，进行大规模生物信息学分析，鉴定出跨膜螺旋相互作用的主流几何构型（分为左旋“Left”、右旋“Right”和GAS_right区域）；2) 基于MSL C++库开发的计算蛋白质设计流程，通过蒙特卡洛算法进行序列设计和侧链优化，能量函数综合考虑了范德华力（CHARMM22）、氢键（SCWRL4）和隐式膜溶剂化（IMM1）效应；3) 高通量实验验证技术TOXGREEN sort-seq，该技术将待测TM结构域与ToxR转录激活因子融合，通过在^{Escherichia coli}膜中的二聚化来激活GFP报告基因表达，并利用流式细胞分选（FACS）和下一代测序（NGS）对大量设计分子库进行并行定量检测；4) 辅助实验包括免疫印迹（Western Blot）验证蛋白表达、MalE互补实验验证膜插入正确性。

设计策略

研究人员首先对已知结构的膜蛋白进行了大规模分析，筛选出所有形成规则α-螺旋且相互作用的螺旋对，并计算了它们的几何参数：交叉角（θ）、螺旋间距离（d）、轴向旋转（ω）和Z位移（Z）。分析结果揭示了两个高密度区域：一个位于左旋区（θ = 20°-40°, d = 8.5-10 ?），另一个位于右旋区（θ = -30°至-60°, d = 7.75-9.5 ?）。而著名的GAS_right motif则位于右旋区中一个更紧密的区域（d = 6.5-7.5 ?）。研究基于一个21个氨基酸的聚亮氨酸（Poly-Leu）骨架进行设计，仅在螺旋-螺旋相互作用的8个界面位置允许氨基酸变化，非界面位置则固定为亮氨酸，以最大限度地保证所有设计分子具有相似的疏水性和膜插入能力。界面允许使用的氨基酸仅限于膜蛋白中最常见的非极性和弱极性氨基酸：丙氨酸（Ala, A）、缬氨酸（Val, V）、亮氨酸（Leu, L）、异亮氨酸（Ile, I）、苯丙氨酸（Phe, F）、色氨酸（Trp, W）、酪氨酸（Tyr, Y）、丝氨酸（Ser, S）和苏氨酸（Thr, T）。为了避免偶然形成GAS_right结构，在Left和Right区域的设计中特意排除了甘氨酸（Gly, G）。最终，他们成功设计了1045个序列，分布在Left、Right和GAS_right三个区域。

实验结果

通过TOXGREEN sort-seq实验，研究人员成功检测了938个设计序列的二聚化倾向。结果表明，绝大多数（约90%）依赖于非极性堆积的Left和Right设计仅表现出微弱或根本检测不到的二聚化信号，其荧光强度分布主要集中在单体或弱二聚体范围。与之形成鲜明对比的是，GAS_right设计则表现出广泛且强劲的二聚化信号，约40%的设计其信号强度达到了已知强二聚体糖蛋白A（GpA）的60%以上，许多甚至更强。为了验证观察到的二聚化确实是通过设计的界面发生的，研究人员为每个设计构建了“碰撞突变体”（Clash mutants），即将界面上的小氨基酸突变为大的异亮氨酸以引入空间位阻。正如预期，这些突变体在所有三个区域都导致了二聚化信号的显著降低，在GAS_right设计中效果尤为剧烈。这强有力地证明，实验观察到的二聚化确实是由设计的特定界面介导的。此外，研究人员还设计了“大氨基酸→丙氨酸”突变体（Large→Ala mutants），以期通过减少界面接触面积来削弱 packing。出乎意料的是，这些突变在Left和Right设计中甚至引起了信号的轻微升高，在GAS_right设计中则未引起显著变化。这表明，在缺乏其他强相互作用的背景下，单纯减少 packing 的效应可能被非特异性弱相互作用的增强所掩盖，或者丙氨酸本身可能更利于非特异性聚集。

能量学分析

研究人员进一步将实验测得的二聚化倾向（TOXGREEN信号）与计算设计时预测的能量得分进行了关联分析。对于Left和Right设计，未能发现任何显著的相关性，这主要是因为这些设计的二聚化信号普遍很低，数据集中在底部，难以评估其趋势。然而，对于GAS_right设计，则观察到了计算能量与实验二聚化强度之间显著的统计学相关性。通过一个此前建立的公式，他们将TOXGREEN信号转换为估计的解离自由能（ΔG°），并再次与计算能量进行对比。结果发现，GAS_right设计的计算能量与估算的ΔG°之间存在良好的线性关系，其回归参数与之前建立的GAS_right二聚化能量模型高度一致。这再次证实了GAS_right motif是一个稳定且可预测的二聚化模块。

研究结论与讨论

本研究通过大规模的计算设计和实验验证，得出一个明确的结论：在跨膜螺旋二聚化中，仅靠非极性氨基酸侧链的堆积和范德华相互作用是一个相对较弱的驱动力。尽管它是膜蛋白折叠中的一个必要因素（缺乏它会 destabilize 结构），但其本身通常不足以驱动形成稳定的二聚体。只有在像GAS_right这样的特殊模体中，当紧密的侧链堆积与弱碳氢键（Cα-H···O=C hydrogen bonds）等其他弱相互作用协同作用时，才能产生强大的二聚化驱动力。

这一发现具有多重重要意义。首先，它深化了我们对膜蛋白折叠能量学的理解，强调了在疏水环境中，即使是微弱的极性相互作用（如弱氢键）也可能在提供稳定性和特异性方面发挥远超范德华力的作用。其次，它对膜蛋白设计领域具有指导意义。研究表明，成功设计一个仅由 packing 驱动的稳定TM二聚体可能需要极其苛刻的侧链互补性，这或许解释了为何自然界中许多稳定的TM相互作用界面都包含了极性残基或像GxxxG这样允许形成弱氢键的模体。最后，该研究并未否定范德华力在膜蛋白中的重要性。在多次跨膜蛋白中，相连的螺旋其二聚化所需能量阈值较低；在单次跨膜受体中，TM区的相互作用也常与胞外域和胞内域的相互作用协同合作。在这些情况下，由 packing 介导的、虽然微弱但特异的相互作用，对于正确的功能（如信号转导中的构象变化）可能已经足够。

总之，这项工作通过严谨的高通量方法揭示了一个基本原理：虽然“紧密堆积”是膜蛋白结构的普遍特征，但真正“驱动”它们聚集在一起的力量，往往来自于那些更“聪明”的相互作用。