地黄来源UGT79G15酶的结构解析揭示苯乙醇苷类化合物1,3-鼠李糖基化催化机制

本研究针对植物苯乙醇苷（PhG）生物合成途径中关键鼠李糖基转移酶UGT79G15的催化机制不明确问题，通过解析其apo形式、UDP结合形式及UDP/底物类似物forsythiaside A三元复合物的晶体结构（分辨率达1.8-2.4 ?），首次揭示了该酶独特的"漏斗状"底物结合口袋和关键残基（His21-Asp118催化二元体、Val139/Gln277/Gln377等）的功能特征。研究人员通过分子对接和点突变实验验证了其区域选择性催化机制，并成功获得催化效率提升2.2倍的I204W突变体。该研究为理性设计糖基转移酶和高效合成药用植物活性成分提供了重要结构基础。

　　

在植物王国中广泛存在的苯乙醇苷类化合物（Phenylethanoid glycosides, PhGs）是一类具有显著药理活性的天然产物，其抗氧化、抗菌、抗病毒和神经保护等功能使其成为药物开发的热点。这类化合物的核心结构通常包含一个β-D-吡喃葡萄糖单元，其C-3'或C-6'位点常被鼠李糖修饰，而这种糖基化模式直接影响化合物的生物活性。尽管近年来科学家已经鉴定出多个参与PhG生物合成的关键酶，但对其中负责鼠李糖基化的糖基转移酶的结构与功能关系仍知之甚少，这严重制约了通过合成生物学手段高效生产这类高价值化合物的进程。

来自地黄（Rehmannia glutinosa）的UGT79G15酶能够特异性催化osmanthuside A的C-3'位鼠李糖基化反应，生成PhG生物合成途径中的关键中间体osmanthuside B。为了深入解析该酶的催化机制，研究人员在《Plant Communications》上发表了这项综合运用结构生物学和酶工程技术的研究成果。

本研究主要采用以下技术方法：通过大肠杆菌表达系统制备重组UGT79G15蛋白，利用镍柱亲和层析和分子筛色谱进行纯化；采用坐滴气相扩散法获得酶晶体，在上海同步辐射光源收集X射线衍射数据；通过分子置换法解析晶体结构，使用AutoDock Vina进行分子对接模拟；采用定点突变技术构建酶突变体，通过HPLC和LC-MS分析酶活性和动力学参数。

Crystallization and overall structures of UGT79G15 and its complexes

研究人员成功解析了UGT79G15的三种晶体结构：apo形式（2.4 ?）、UDP结合形式（1.8 ?）以及UDP与底物类似物forsythiaside A结合的三元复合物形式（2.12 ?）。结构分析显示该酶采用典型的GT-B折叠构象，由N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）形成狭窄的催化裂隙。特别值得注意的是，forsythiaside A因其C-6'位鼠李糖基阻止了咖啡酰基的自发迁移，能够稳定地与酶结合，从而为结构解析提供了理想条件。

Catalytic mechanism of UGT79G15

结构分析发现His21-Asp118催化二元体在催化过程中起关键作用，His21作为广义碱夺取3'-OH的质子，使其亲核攻击UDP-鼠李糖的异头碳原子。分子对接结果显示，forsythiaside A的3'-OH与鼠李糖C-1'之间的距离超过7 ?，表明催化过程中底物需要发生构象调整才能完成反应。点突变实验证实H21A突变体完全丧失活性，而H21N和D118H等突变体活性显著降低，验证了SN2-like亲核取代反应机制。

Recognition and binding of UDP-Rha

研究人员发现UGT79G15对UDP-鼠李糖具有严格特异性，其他糖供体如UDP-葡萄糖、UDP-木糖等均不能被识别。结构分析表明Q377与鼠李糖 moiety形成稳定相互作用（2.5 ?），而V139与鼠李糖甲基基团形成疏水相互作用。V139T突变体几乎完全丧失催化活性，说明该残基在UDP-鼠李糖识别中起关键作用。此外，Q277既能与UDP-鼠李糖相互作用（3.2 ?），又能与osmanthuside A的4-OH形成氢键（2.9 ?），具有双重功能。

The unique pocket for acceptor binding and roles of key residues for catalytic activity

最引人注目的发现是UGT79G15具有一个独特的"漏斗状"底物结合口袋，这与已知的结合萜类和黄酮类底物的植物UGTs的"V形"或"U形"口袋显著不同。在该口袋底部发现了一个由Phe119、Ile140、Ile149、Phe200和Ile204等疏水残基形成的辅助洞穴，专门用于容纳forsythiaside A的4'-咖啡酰基。系统发育分析表明UGT79G15的同源物形成一个独立分支，与黄酮类GGTs具有较近的亲缘关系，说明这种漏斗状口袋是对PhG底物的适应性进化结果。

通过丙氨酸扫描突变，研究人员发现W16A、F119A和Y195A等突变体活性显著降低，说明这些残基对维持底物结合口袋的重要性。特别值得注意的是，I204W突变体对osmanthuside A的催化效率（k_cat/K_m）比野生型提高了2.2倍，这归因于色氨酸较大的侧链增强了与底物咖啡酰基的疏水相互作用，且其氮原子可能与底物形成氢键。

该研究首次提供了UGT79G15与底物类似物的三元复合物结构，揭示了PhG 1,3-鼠李糖基转移酶独特的底物识别机制和区域选择性催化原理。结构分析发现的关键残基及其功能验证为理性设计糖基转移酶提供了重要依据，而获得的I204W等高活性突变体为通过合成生物学手段高效生产苯乙醇苷类药用成分奠定了坚实基础。这项研究不仅丰富了植物UGTs的结构信息，也为天然产物生物合成途径中糖基化机制的深入理解提供了新的视角。