LGR4-RSPO复合物冷冻电镜结构揭示靶向纳米抗体抗肥胖治疗新策略

本研究针对肥胖缺乏有效治疗手段的全球健康难题，通过冷冻电镜技术解析了全长LGR4及其与RSPO2复合物的高分辨率结构，并开发出特异性纳米抗体NB21。该抗体能有效阻断LSPO1/2与LGR4的结合，抑制经典Wnt/β-catenin信号通路，促进米色脂肪产热和能量消耗，在饮食诱导和ob/ob遗传性肥胖模型中均表现出显著减重效果。研究为肥胖治疗提供了新的靶点和治疗策略，展现了结构生物学驱动的药物研发优势。

　　

肥胖已成为威胁全球健康的重大公共卫生问题，与糖尿病、心血管疾病和癌症等多种并发症密切相关。据预测，到2025年全球约20%的成年人将受到肥胖影响。目前肥胖防治方法包括生活方式干预和减重手术等，但这些方法往往效果有限且风险较高。虽然已有一些抗肥胖药物，但由于严重的神经精神和心血管不良反应，这些药物通常只能短期使用。因此，寻找新的靶点和开发安全有效的减重治疗方法迫在眉睫。

随着大规模深度测序技术的发展，人类基因组研究为药物研发带来了新机遇。典型案例如GPR75，通过英国生物银行研究被发现是一个令人兴奋的新抗肥胖靶点。与此同时，冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的进步极大地加速了我们对配体识别和受体激活的理解，特别是在各种G蛋白偶联受体（GPCR）方面，这些技术已被用于基于结构的药物设计（SBDD）。将深度测序的新靶点识别与利用冷冻电镜技术开发其结构辅助的选择性阻滞剂相结合，似乎是一个值得研究的有前景的策略。

在中国年轻人肥胖遗传学（GOCY）研究中，发现富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4（LGR4，也称为GPR48）的功能获得性突变（p.A750T）是年轻人严重肥胖的易感因素。几乎同时，冰岛的deCODE研究显示，300多名携带LGR4罕见功能缺失突变（p.R126X）的个体体重减轻。LGR4缺失通过促进前脂肪细胞从白色向棕色脂肪细胞转化，增强能量消耗并减少肥胖。LGR4作为GPCR超家族的新成员，在维持内分泌和心脏代谢稳态中起关键作用，近年来受到广泛关注。遗传和生物学证据表明LGR4可能是肥胖的潜在治疗靶点，但由于其胞外域（ECD）凹面上存在两个过于平滑弯曲的β片层，开发针对LGR4胞外域的小分子拮抗剂目前被认为具有挑战性。

LGR4由一个富含17个亮氨酸重复序列（LRR）的大胞外域、一个富含半胱氨酸的铰链区、一个7次跨膜结构域（7-TMD）和一个短胞内结构域组成。至少已报道了四种不同的LGR4内源性配体，包括R-spondin（RSPO）1/2/3/4、Norrin、Nidogen-2和RANKL。值得注意的是，我们先前的研究与其他研究均表明，RSPO1/2与LGR4的结合可通过放大经典Wnt/β-catenin信号通路来抑制米色脂肪产热或促进白色脂肪细胞 adipogenesis，从而导致肥胖。RSPO包含一个N端信号肽、两个furin样结构域（FU1和FU2）、一个血小板反应蛋白1型重复（TSR）结构域和一个C端结构域。晶体结构分析表明，RSPO1的FU2通过静电和疏水相互作用与马蹄形LGR4（ECD）的凹面结合。尽管许多研究专注于LGR4和LGR4-RSPO复合物的结构，但由于若干技术瓶颈，对全长LGR4完整结构的解析仍然未解决，而这对全面理解细胞信号转导和药物开发至关重要。

在此背景下，利用中和性纳米抗体抑制LGR4，并辅以结构确认，可能成为减重的一种有价值的方法。此外，专注于直接阻断LGR4与RSPO结合位点的抗体有助于最小化副作用并提高抗肥胖治疗效应的特异性。

发表在《Nature Communications》的这项研究，成功利用冷冻电镜解析了全长LGR4蛋白及其与RSPO2（FU）复合物的结构，并鉴定出纳米抗体NB21作为LGR4阻滞剂，可破坏RSPO1/2与LGR4的结合。NB21-mFc（NB21与小鼠IgG2融合）在体外和体内通过抑制经典Wnt信号通路促进产热对抗肥胖。该研究凸显了靶向LGR4的纳米抗体NB21作为减重药物的潜力。

研究采用了多项关键技术方法：利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析了全长LGR4单独及与RSPO2(FU)复合物的高分辨率结构；通过纳米抗体噬菌体展示库筛选获得特异性LGR4抑制剂NB21；采用生物层干涉技术（BLI）测定结合亲和力和竞争性结合；使用TOPFlash荧光素酶报告基因检测Wnt信号通路活性；通过小鼠模型（包括饮食诱导肥胖和ob/ob遗传性肥胖模型）进行体内功能验证；对来自小鼠白色脂肪组织的基质血管组分（SVFs）进行体外米色脂肪细胞分化实验。

Cryo-EM structures of LGR4 alone and in complex with RSPO2(FU)

研究人员首先解析了全长LGR4的结构。LGR4(ECD)结构呈现独特的马蹄形状，由17个LRR基序组成，赋予其动态灵活性。为促进结构测定，研究人员生成了靶向LGR4 ECD的高亲和力纳米抗体（NB52），解离常数（K_D）为3.88±0.47 nM。该纳米抗体进一步扩展为更大的"megabody"（MB52）以增加颗粒大小和优化方向，有效作为基准标记。全长LGR4（LGR4-apo）结构在MB52存在下获得，分辨率约3.03 ?，产生了清晰的图谱，使其ECD和7-TMD能够放入结构模型，并允许明确指认大多数氨基酸的侧链。LGR4的整体结构与促黄体激素受体（LHCGR/LGR2）和促甲状腺激素受体（TSHR/LGR3）相似。然而，LGR4(ECD)形成了一个延伸且弯曲的弧，跨越180度。该结构显示ECD相对于膜层呈直立构象，类似于带有轻微右旋的右手螺旋管。同时，LGR4的7-TMD类似于Rhodopsin和β₂肾上腺素能受体等A类GPCR中的非活性构象。

为探究RSPO2是否诱导LGR4构象变化，研究人员测定了LGR4-RSPO2(FU)复合物的冷冻电镜结构，整体分辨率为3.06 ?。结果显示LGR4与RSPO2(FU)形成1:1化学计量复合物。RSPO2(FU)通过其FU2结构域结合到ECD顶部附近的凹面内表面，与先前报道的LGR4(ECD)-RSPO1复合物结构一致。比较LGR4-apo和LGR4-RSPO2(FU)二元复合物的结构，观察到高度结构相似性，除了某些相互作用残基侧链的轻微干扰。将LGR4-apo的7-TMD与LGR4-RSPO2(FU)复合物中的对齐显示出强烈的结构重叠。尽管两个结构中的7-TMD大部分重合，但ECD的旋转有轻微改变。在复合物中，与LGR4-apo相比，LGR4(ECD)向7-TMD旋转了2.5度，导致LGR4(ECD)相对于7-TMD的倾斜度减少了3.5度。该复合物中LGR4(ECD)的方向也与最近报道的非活性LHCGR/LGR2和TSHR/LGR3结构中的方向一致，表明RSPO2(FU)结合本身并未诱导LGR4向活性构象转变。

LGR4-RSPO2(FU)相互作用主要集中于LGR4内的LRR3-LRR7重复序列，这些序列与来自RSPO2(FU)两个FU结构域的残基结合。它埋藏了约2200.96 ?²的溶剂可及表面积。界面可剖析为两个 distinct 区域。第一个结合位点由多个极性相互作用稳定。具体而言，盐桥形成于RSPO2(FU)的R86与LGR4的D137、D161和D162之间，以及来自RSPO2(FU) FU结构域的K58与LGR4的D162之间。此外，来自RSPO2(FU) FU2结构域的R123和K127分别与LGR4的E228和E252建立盐桥。还观察到RSPO2(FU)的H76、R121和D108与LGR4的Q113、N226和T229之间的氢键。第二个位点以疏水斑块为特征，发生交错堆叠结合。该相互作用涉及来自RSPO2(FU) FU2结构域的F105和F109，以及来自LGR4的H157、W159、A181、V204、V205和H207。RSPO1/2和LGR4界面处最关键的结合残基高度保守。相比之下，它们的FU1结构域的构象差异显著。

值得注意的是，由于电子密度不足，ECD内的环区（残基472-520）在我们的冷冻电镜结构中未解析。AlphaFold3建模显示RSPO2(FU)结合位点在空间上远离此未建模区域，表明了一种与卵泡刺激素（FSH）诱导的卵泡刺激素受体（FSHR/LGR1）激活不同的机制，在后一过程中该区域至关重要。与FSHR-FSH复合物的G蛋白依赖性信号传导不同，我们的数据表明RSPO可能以G蛋白非依赖性方式调节LGR4活性。

Development of a nanobody blocking the LGR4-RSPO1/2 complex

基于已建立的LGR4靶向纳米抗体噬菌体展示库，研究人员筛选出在TOPFlash实验中表现出显著抑制LGR4特性的NB21。发现NB21对LGR4(ECD)具有高结合亲和力，K_D为1.12±0.04 nM，并能有效竞争RSPO1/2结合。随后，研究人员解析了LGR4-NB21复合物的冷冻电镜结构，标称分辨率为3.64 ?。

密度图表现出卓越质量，能够构建蛋白质的主链和侧链。NB21通过其互补决定区（CDR）附着到ECD上端附近的凹面内表面。该相互作用导致LGR4上约2260.04 ?²的溶剂可及表面积被埋藏。值得注意的是，NB21的方向几乎垂直于细胞表面，与RSPO2(FU)的结合方向形成对比。此外，与G蛋白依赖性信号传导不同，将LGR4-NB21复合物与未结合的LGR4结构叠加，观察到高度结构一致性，除了由NB21诱导的特定残基侧链的轻微扰动。

将LGR4-RSPO2(FU)复合物与LGR4-NB21复合物叠加后，明显看出NB21的结合表位与RSPO1/2在LGR4上的结合位点重叠。这种重叠有效阻碍了LGR4与RSPO1/2之间的相互作用，这对RSPO1/2桥接LGR4和ZNRF3/RNF43以增强经典Wnt信号传导至关重要。因此，NB21破坏了这种关联，理论上导致经典Wnt信号转导受损。

结构分析显示，NB21通过其三个CDR与LGR4建立相互作用，特异性靶向LGR4上的LRR4/5/8/10。NB21实现的结合通过形状互补性实现，保持了LGR4的构象而不破坏。该界面的主要组成部分是一个亲水相互作用网络。在该相互作用的位点I，NB21的K31侧链与LGR4上的D137和D161侧链形成两个盐桥，这也是RSPO1/2的结合残基。此外，K31还参与与LGR4的W159芳香环的阳离子-π相互作用。而且，NB21的Y32酚羟基捐赠一个氢键给LGR4中D162的侧链羧基。Y27的芳香环和LGR4中的H157参与π-π相互作用，并与LGR4中的W159形成疏水相互作用。在该相互作用的位点II，NB21的R100与LGR4中的E228形成盐桥，而NB21的S102与LGR4中的D231和N233形成两个氢键。此外，这些残基在人和小鼠LGR4之间显示完全同一性，表明NB21可能是一种物种交叉反应性纳米抗体。发现NB21对小鼠LGR4具有高结合亲和力，K_D为2.35±0.13 nM。为提高NB21的生物利用度，研究人员设计并表达了NB21-mFc（NB21与小鼠IgG2融合），并将其应用于后续的体外和体内功能实验。

NB21-mFc blunts the effects of RSPO1/2 on beige adipocytes

先前研究揭示，人类RSPO1和LGR4的种系功能获得性突变通过经典Wnt信号通路抑制白色脂肪细胞的褐变能力，从而促进肥胖。为评估NB21在此过程中的作用，首先用hRSPO1单独或联合NB21-mFc处理来自C57BL/6J小鼠皮下白色脂肪组织（sWAT）的基质血管组分（SVFs）。hRSPO1处理观察到的活性（非磷酸化）和总β-catenin水平增加在加入NB21-mFc后减弱。一致地，NB21-mFc抑制了由hRSPO1触发的核β-catenin积累，并减轻了其对经典Wnt信号通路激活标志物Tcf7l2以及其他靶标如Axin2、Wisp2、Nkd1、CyclinD1和c-Myc转录的影响。RSPO2也激活了经典Wnt信号通路并抑制了米色脂肪细胞的褐变进程。与NB21阻断RSPO1/2在LGR4上的共享结合位点一致，NB21-mFc以剂量依赖性方式抑制了RSPO1或RSPO2在米色脂肪细胞中诱导的经典Wnt信号通路激活和产热基因表达。这些发现表明NB21-mFc可减弱RSPO1/2对经典Wnt信号通路和米色脂肪细胞产热基因表达的影响。

NB21-mFc boosts thermogenesis in vivo

接下来，研究人员评估了NB21-mFc是否能在体内促进产热。腹腔注射NB21-mFc 7天后，小鼠显示轻度体重减轻和脂肪量减少。以体重作为协变量进行ANCOVA分析，观察到NB21-mFc处理小鼠的总能量消耗（EE）显著增加。此外，在NB21-mFc处理组中观察到呼吸交换比（RER）轻微增加。两组之间在累积食物摄入、体力活动或粪便热量损失方面未检测到差异。在急性冷暴露下，NB21-mFc处理小鼠表现出更高的EE和核心温度。而且，在慢性暴露于寒冷7天后，在NB21-mFc处理组中观察到内脏白色脂肪组织（vWAT）、sWAT和棕色脂肪组织（BAT）中更小的脂肪细胞，以及vWAT和sWAT中UCP1蛋白表达增加。一致地，产热基因（包括Ucp1、Cidea和Dio2）和线粒体呼吸基因（如Pgc1a和Ndufa8）的mRNA水平在NB21-mFc处理组的这些脂肪库中显著升高。而且，UCP1连同线粒体呼吸链的蛋白水平，包括UQCRC2（复合体III）、MTCO1（复合体IV）和NDUFB8（复合体I），在NB21-mFc处理组中增加。总之，这些结果揭示NB21-mFc增强了小鼠的脂肪产热和能量消耗。

NB21-mFc's inhibition on browning depends on LGR4

RSPO1与LGR4结合对褐变产生强烈抑制，而RSPO2的有效浓度比RSPO1高约20倍，与先前发现一致。对已发表的小鼠白色脂肪组织（WAT）单细胞数据集的进一步分析表明，Rspo1的表达水平在整个WAT中远高于Rspo2。这种趋势在脂肪干细胞和祖细胞（ASPC）亚群中也观察到，这些细胞在维持脂肪组织稳态和促进脂肪生成中起关键作用。类似地，qPCR分析证明Rspo1在vWAT SVFs中表达最高，其中ASPC代表主要细胞群体，显著超过所有三种脂肪组织中Rspo2的表达水平。接下来，研究人员验证了NB21-mFc对LGR4-RSPO1复合物褐变抑制的中和作用在缺乏LGR4的米色脂肪细胞（Lgr4^m/m）中被消除，这得到米色脂肪细胞产热和线粒体呼吸基因表达变化以及诱导米色脂肪细胞耗氧能力变化的支持。

尽管NB21是专门设计用于靶向LGR4的ECD，但序列比对显示NB21结合区域在LGR4、LGR5和LGR6之间保守，提出了交叉反应性的可能性。虽然Lgr4在脂肪组织中的表达水平也显著高于Lgr5和Lgr6，为进一步排除LGR5或LGR6介导NB21在米色脂肪细胞中作用的可能性，研究人员进行了针对Lgr5和Lgr6的慢病毒介导的敲低实验。值得注意的是，无论Lgr5或Lgr6的有效沉默如何，NB21-mFc始终减轻了RSPO1对米色脂肪细胞产热的抑制作用。这些发现证明NB21-mFc主要通过LGR4而非LGR5或LGR6增强脂肪组织中的产热能力。

然后，研究人员旨在测试NB21-mFc是否能对抗肥胖。首先评估了NB21在饮食诱导肥胖中的潜在减重效果。在高脂饮食（HFD）下，雌性8周龄小鼠每隔一天腹腔注射一次NB21-mFc（0.2 mg kg^-1）或PBS，持续6周。有趣的是，NB21-mFc显著降低了雌性野生型（WT）小鼠的体重，主要归因于vWAT和sWAT的减少，表现为更小的脂肪细胞和更强烈的褐变标志物（UCP1）染色。与体外发现一致，NB21-mFc增强了vWAT和sWAT中产热和线粒体呼吸相关基因的表达。在BAT中观察到一致但相对轻微的变化。随着饮食诱导的肥胖减少，NB21-mFc也减少了肝脏脂质积累。重要的是，NB21-mFc在Lgr4^m/m同窝仔中失去了上述褐变增强和抗肥胖作用。同时，研究人员观察到NB21-mFc在雄性WT小鼠中产生类似的代谢益处，但在Lgr4^m/m同窝仔中则无。总体而言，这些发现表明NB21-mFc主要通过LGR4依赖性方式促进产热能力来减轻饮食诱导的肥胖。

NB21-mFc reduces adiposity in ob/ob mice

Lgr4缺失甚至可以在瘦素单基因突变诱导的严重肥胖模型中减少肥胖。研究人员接下来研究了NB21在瘦素缺乏（ob/ob）小鼠中的抗肥胖效果。8周龄ob/ob小鼠以相对低剂量（0.03 mg kg^-1或0.1 mg kg^-1）每隔一天用NB21-mFc处理。治疗7天后，NB21-mFc处理的ob/ob小鼠表现出总EE显著增加和RER降低。两组之间在累积食物摄入、体力活动或粪便热量损失方面未检测到差异。治疗7周后，NB21-mFc处理的ob/ob小鼠表现出剂量依赖性的体重下降，伴随脂肪量减少和瘦体重增加。具体而言，三种脂肪组织包括BAT、sWAT和vWAT的重量在NB21-mFc治疗后均显著降低。在NB21-mFc治疗后，在BAT、sWAT和vWAT中观察到更小的脂肪细胞以及增强的UCP1蛋白染色。一致地，产热基因和线粒体呼吸相关基因的mRNA水平在NB21-mFc处理（0.1 mg kg^-1）的ob/ob小鼠的BAT和sWAT中升高，在vWAT中观察到增加趋势。同时，肝脏中严重的异位脂质积累被NB21-mFc减弱。此外，NB21-mFc处理的ob/ob小鼠在三种脂肪组织中显示炎症标志物减少，尤其是Ccl2、Tnfα和Il6。这些发现表明相对短期使用NB21-mFc不会引起明显的免疫反应，而是减轻肥胖相关的慢性炎症，进一步支持其治疗潜力。总之，这些数据表明NB21-mFc治疗甚至可以在由遗传缺陷引起的严重肥胖模型中减少肥胖。

研究结论与讨论部分强调，近期大规模人群或极端病例的遗传学研究取得的成就已经产生了许多新的潜在抗肥胖靶点，特别是包括可成药的GPCR。尽管在过去十年中广泛采用基于结构的药物设计方法，但靶向GPCR的成功仍然有限。常规GPCR结晶的高挑战性构成一个关键因素。本研究成功解析了全长LGR4的冷冻电镜结构，并进一步描述了LGR4与其一种配体RSPO2复合的分子细节。在此背景下，开发了一种中和纳米抗体（NB21），可精确靶向LGR4-RSPO1/2结合结构域，从而特异性阻断RSPO1/2与LGR4的结合。重要的是，体外和体内实验均证实了NB21-mFc在促进产热和减重方面的功效。

从识别分子靶点到药物批准的过程通常漫长且成本高昂，平均需要25年。在减重药物领域，GLP-1R激动剂在GLP-1发现约18年后获准上市。随着经过遗传验证的药物靶点日益增多，必须采用创新方法学（如结构生物学信息）来减轻与药物开发相关的费用和持续时间。在简短时间框架内，通过深度测序在严重肥胖病例中成功识别出潜在靶点LGR4，随后利用冷冻电镜辅助验证筛选和鉴定出潜在中和纳米抗体NB21。预计该策略将加速针对肥胖候选靶点的SBDD和优化技术的临床实施。

LGR4-RSPO-ZNRF3/RNF43模块在维持经典Wnt和其他信号通路的稳态方面起关键调节功能，从而控制干细胞的状态和发育，以及能量稳态等生理过程。与RSPO1促进肥胖的发现一致，Dong等人报道RSPO2过表达导致肥胖和胰岛素抵抗，这取决于LGR4。理论上，开发RSPO1/2阻断药物（如中和抗体）可能导致能量消耗增加和体重减轻是合理的，但至少需要两种分别靶向RSPO1和RSPO2的有效抗体来阻断LGR4激活。此外，RSPO2缺失导致指端发育不良和胎儿死亡，这一过程取决于ZNRF3/RNF43而非LGR4，表明特异性靶向LGR4-RSPO1/2复合物的NB21可能规避这些不良反应。因此，在减重药物设计中，优先开发具有高选择性的中和抗体显得更为重要。

该研究解析了全长LGR4-apo及其与RSPO2(FU)复合物的结构，为未来药物设计提供了必要的结构指导。此外，成功开发了一种LGR4特异性纳米抗体NB21，并确定了其与LGR4的复合物结构。NB21表位与RSPO1/2在LGR4上的结合位点重叠，提供了一种选择性机制来抑制这种相互作用。NB21-mFc代表了一种通过增加