听觉关联皮层-黑质通路特异性招募SNL多巴胺神经元调控听觉威胁记忆的新机制

本研究针对听觉威胁记忆形成的神经机制，发现黑质外侧部多巴胺神经元（SNL DANs）具有独特的生理特性，接受听觉关联皮层（AuV/TeA）的特异性输入。通过光遗传学、电生理和行为学实验，证明抑制SNL DANs或皮层到SNL的输入均会损害听觉威胁条件反射。该发现揭示了直接皮质黑质通路在调节威胁行为中的重要作用，为创伤后应激障碍（PTSD）和恐惧症的治疗提供了新靶点。

　　

在神经科学领域，中脑多巴胺神经元（DANs）传统上被认为主要参与奖赏处理和运动控制。然而，越来越多的证据表明，这些神经元在厌恶和威胁行为中也发挥着关键作用。特别是黑质外侧部（substantia nigra pars lateralis, SNL）的多巴胺神经元，它们投射到纹状体尾部（tail of striatum, TS），在处理显著、新颖和厌恶刺激中至关重要。尽管如此，人们对威胁行为期间调控SNL DANs活动的周围环路仍知之甚少。

听觉威胁条件反射涉及听觉皮层，后者与杏仁核和纹状体相互作用，以实现听觉威胁记忆的获取和建立。然而，听觉皮层是否通过直接的黑质皮层通路（corticonigral pathway）在威胁信号处理过程中直接调节DANs尚不清楚。解剖学研究已经确定了皮层到黑质的投射，但这些投射的功能以及它们是否参与威胁条件反射仍有待阐明。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Lorenzo Sansalone等人揭示了听觉关联皮层（包括次级听觉皮层AuV和颞叶关联皮层TeA）向SNL DANs提供特异性投射，这些投射在听觉威胁条件反射的记忆检索中显著贡献。研究人员通过光学激活听觉皮层的投射，显著增加了SNL DANs的放电频率。相比之下，内侧或外侧黑质致密部（SNc）的DANs几乎不接受来自听觉关联皮层的功能输入。

通过比较SNL、外侧SNc（ISNc）和内侧SNc（mSNc）DANs的特性，研究发现SNL DANs代表一个独立的神经元亚群，其特征是不规则的起搏活动和显著更高的最大放电频率。这些发现得到了生物物理学实验的进一步支持，证明了SNL和SNc DANs中表达的基础离子通道存在差异。

最后，听觉威胁条件反射实验表明，使用病毒表达的破伤风毒素（tetanus toxin）破坏从SNL DANs到纹状体尾部的突触传递，显著减少了巴甫洛夫范式中的威胁学习（CS-US关联）。重要的是，阻止从听觉皮层到SNL DANs的突触释放影响了威胁学习和听觉威胁记忆的检索。这些发现揭示了一条皮质黑质通路，该通路直接影响参与听觉相关厌恶行为的中脑DANs的活动。

研究人员主要应用了以下关键技术方法：采用转基因小鼠模型（如DAT-Cre、VGluT2-Cre、Calb-Cre等）进行细胞特异性靶向；通过立体定位注射病毒载体（如AAV-CoChR、AAV-DIO-eGFP-TetTx等）实现特定神经环路的标记与操控；利用脑片膜片钳技术（包括全细胞、细胞附着式和穿孔膜片钳记录）详细表征SNL与SNc多巴胺神经元的内在放电特性、突触后电流及光遗传学刺激反应；运用荧光原位杂交（FISH）技术检测酪氨酸羟化酶（TH）、钙结合蛋白（Calbindin）和囊泡谷氨酸转运体2（VGluT2）等的共表达；通过逆行追踪技术（CTB-647注射）解析SNL DANs的输入网络；并设计巴甫洛夫式听觉威胁条件反射行为学范式，结合FreezeFrame系统量化分析小鼠的冻结行为，以评估记忆形成与提取。

SNL DA神经元表现出相对于SNc DA神经元不同的内在放电特性

通过原位杂交实验，研究发现SNL DANs的胞体面积比SNc DANs小约30%。全细胞膜片钳记录显示，SNL DANs的自发放电频率显著低于SNc DANs，且起搏活动高度不规则，其 interspike interval（ISI）的变异系数（CV ISI）远高于SNc DANs。测试最大放电频率时，SNL DANs表现出显著更高的平均最大放电频率（45.08±4.85 Hz），而SNc DANs的最大放电频率较低（mSNc为20.93±0.78 Hz，ISNc为16.12±1.04 Hz）。此外，在自发起搏期间，SNL DANs的 afterhyperpolarization（AHP）电压更去极化，SK电导更低，超极化时的 sag电压更小，表明其 hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated（HCN）通道招募较弱。通过电压钳记录比较 miniature excitatory and inhibitory post-synaptic currents（mEPSC和mIPSC），发现SNL DANs的mEPSC频率显著更高，而mIPSC频率显著更低，表明它们主要接受兴奋性输入，这与已知主要受抑制调控的SNc DANs形成鲜明对比。

功能输入图谱显示听觉关联皮层特异性支配SNL DA神经元

通过将Cholera Toxin Subunit B conjugated to Alexa Fluor 647（CTB647）注射到SNL进行逆行标记，发现在听觉关联皮层（AuV/TeA）的第2/3和5层有强烈的标记。通过在AuV/TeA注射AAV-CoChR病毒，并在DAT-Cre Ai9小鼠的SNL、ISNc和mSNc DANs上进行细胞附着记录，光遗传学刺激（470 nm，2秒，20 Hz，2 ms脉冲）显著增加了SNL DANs的放电频率（从1.14±0.11 Hz增加到11.32±0.93 Hz），而SNc DANs的放电频率没有显著变化。电压钳记录显示，SNL DANs在光刺激下产生明显的光诱发突触后电流（oPSC），而mSNc和ISNc DANs则没有。在加入 tetrodotoxin（TTX）和4-aminopyridine（4-AP）后，SNL DANs仍对单光脉冲产生清晰的oPSC，表明从AuV/TeA到SNL DANs的投射是单突触性质的。通过阻断兴奋性 synaptic receptors（D-AP5和NBQX），光遗传学刺激诱导的SNL DANs放电增加被显著抑制，表明其兴奋主要由AMPA和NMDA受体的激活驱动。

投射到纹状体尾部的DA神经元参与听觉威胁学习

SNL DANs有助于厌恶学习，它们向纹状体尾部（TS）的投射参与威胁回避学习。为了测试TS中释放的DA在听觉威胁条件反射中的作用，研究人员通过在其终端 retrograde viral infection with a virus that expresses tetanus toxin light chain (TetTx)来抑制投射到TS的DANs的突触传递。在DAT-Cre小鼠的TS注射Cre依赖性病毒，AAV-DJ-DIO-eGFP-TetTx（处理组）或AAV-DIO-eGFP（对照组）。威胁条件反射范式包括：第1天（Context A）——适应阶段（纯音调，5kHz，30秒 duration，呈现5次），随后是条件反射阶段（纯音调与电击 footshock，0.6mA，1s，共同终止）；24小时后第2天，将条件反射动物置于新 context（Context B），进行检索阶段（呈现纯音调，无电击）。结果显示，表达TetTx的小鼠在条件反射阶段和检索阶段的冻结行为均显著减少，表明抑制从SNL DANs到TS的神经递质释放干扰了听觉威胁记忆的编码和巩固。

皮层向SNL DA神经元的传递有助于听觉威胁条件反射的 conditioning 和检索

研究表明，听觉关联皮层向SNL DANs提供强烈的兴奋；然而，皮层输入对SNL DANs的行为后果尚不清楚。为了测试AuV/TeA->SNL投射在威胁学习中的贡献，研究人员通过用TetTx感染SNL投射皮层神经元来抑制从SNL投射皮层神经元的传递。在C57WT小鼠中，首先将逆行AAV9-Cre注射到SNL以靶向AuV/TeA神经元，随后将AAV-DIO-eGFP-TetTx注射到AuV/TeA，以选择性在SNL投射神经元中表达TetTx。使用频率调制音调（FM tones，5-20kHz，0.5s音调，1Hz，30秒 duration）的巴甫洛夫威胁条件反射范式进行评估。结果显示，表达TetTx的小鼠在条件反射和检索阶段的冻结行为均显著减少。为了区分情境和听觉威胁条件反射，研究人员在新的动物队列中使用不同的 context 进行条件反射（Context A）和检索（Context B），并使用纯音调（5kHz，30秒 duration）。结果显示，抑制从AuV/TeA到SNL的神经递质释放干扰了听觉威胁条件反射。此外，在第3天将小鼠放在条件反射笼中5分钟（无声音或电击）量化情境冻结时，发现处理组小鼠的冻结行为显著减少，表明SNL投射的TeA皮层神经元的破坏可能 underlying 情境威胁条件反射的影响。

本研究证明，位于黑质外侧部（SNL）的多巴胺神经元（DAN）构成了一个功能上独特的亚群，由其内在特性、突触输入和对威胁条件反射的行为贡献所定义。SNL DANs的 intrinsic properties 表明，它们以不规则放电和高最大放电频率为特征，这可能是由于与SNc DANs不同的离子通道补充所致。对不同脑核突触投射的检查显示，SNL DANs是独特的，接收不同于SNc DANs的输入。研究人员揭示了听觉关联皮层（包括次级听觉皮层AuV和颞叶关联皮层TeA）向SNL DANs提供强大而特异的输入，这可能有助于听觉威胁条件反射。相比之下，SNc DANs不受皮层输入的影响。重要的是，抑制听觉关联皮层终端的突触释放显著损害了听觉威胁条件反射。因此，这些结果扩展了关于多巴胺系统在调节动物行为中的知识，表明厌恶反应和威胁条件反射可能涉及从皮层投射到SNL DANs的直接通信。

这些发现对于理解运动和精神障碍具有重要意义。本研究揭示了SNL DANs的生理特性和环路连接，这些神经元不直接参与运动控制，与SNc DANs不同。在帕金森病（PD）神经退行性变过程中，SNc DANs丢失，而SNL DANs相对保留。这里证明的这些不同亚群的内在特性和环路的明显差异，可能为了解多巴胺神经元在PD中细胞死亡的选择性脆弱性提供 insight。此外，大多数PD研究关注运动症状，但对非运动症状在PD患者中出现的原因了解较少。本研究揭示了SNL中产生多巴胺的神经元 previously unknown 功能，有助于理解PD患者非运动症状的病理生理学。

重要的是，这些数据可能有助于理解人类精神障碍，如创伤后应激障碍（PTSD）和恐惧症，其中对感觉刺激威胁价值的错误评估可能引发异常的生理反应。PTSD和恐惧症中临床症状的严重程度与感觉区域有关，表明感觉 processing dysfunction 可能 contribute to 症状的严重程度。SNL DANs的独特特性，包括更快的放电和更高的输入 resistance，可能有助于快速的感觉反应，这可能对威胁学习有利。这里报告的听觉关联皮层和SNL中多巴胺神经元的相互作用有助于威胁条件反射，提高了这条通路可能参与PTSD和恐惧症中环路功能障碍的可能性。总之，这些发现提供了一个框架，可能有助于未来的研究识别在厌恶行为期间下游区域中皮层感觉处理的机制。