MRAP2调控黑素皮质素4受体信号传导与寡聚化状态的作用机制及其代谢意义

本研究针对黑素皮质素4受体（MC4R）信号调控机制这一能量代谢领域的核心问题，通过多学科技术手段揭示了MRAP2蛋白对MC4R功能的多重调控作用。研究人员发现MRAP2共表达可增强MC4R的Gs/Gq介导的信号传导，同时抑制β-arrestin2招募和受体内化，并通过破坏受体寡聚化状态增加单体形成。这项研究为理解MC4R相关代谢疾病的发病机制提供了新的分子视角，对肥胖等代谢性疾病的治疗策略开发具有重要指导意义。

　　

在能量稳态调控的复杂网络中，黑素皮质素4受体（melanocortin-4 receptor, MC4R）作为G蛋白偶联受体（GPCR）家族的关键成员，扮演着食欲和新陈代谢调节的核心角色。该受体的功能异常与人类肥胖症的发生发展密切相关，迄今为止已有超过160种MC4R基因变异被证实与肥胖表型相关。然而，MC4R信号传导的精细调控机制仍未完全阐明，特别是关于 melanocortin-receptor accessory protein 2（MRAP2）对这一过程的影响机制存在诸多未知。

MRAP2是一种单次跨膜螺旋蛋白，已知能与多种GPCRs相互作用，包括食欲素1受体（OX₁R）、前动力蛋白受体（PKR1）和生长激素促分泌素受体（GHSR1a）等。尽管先前研究表明MRAP2与MC4R在调节能量平衡中具有重要作用，但其具体作用机制和对受体功能的全面影响仍待深入探索。特别是在下丘脑室旁核（PVN）等重要脑区，MRAP2与MC4R信使RNA的表达比例约为3:1，这种共表达模式暗示着两者在生理条件下可能存在功能上的交互作用。

为了解决这些科学问题，来自德国、加拿大、英国等多国研究机构组成的国际团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。研究人员运用荧光/生物发光共振能量转移（FRET/BRET）技术、单细胞成像和功能分析等多种先进方法，系统阐述了MRAP2对MC4R信号传导和超分子组织状态的调控作用。

研究团队采用的关键技术方法包括：基于Epac-S^H187 FRET生物传感器的cAMP检测技术、基于纳米抗体35（Nb35）的Gs蛋白激活监测、TIRF显微镜实时成像、bioluminescence-complementation（NanoBiT）技术检测β-arrestin2招募、单分子亮度分析（SpIDA）测定受体寡聚化状态、荧光互相关光谱（FCCS）验证蛋白相互作用，以及放射性配体结合实验等。

MRAP2表达增强Gs介导的cAMP积累

研究人员发现，MRAP2共表达显著增强了MC4R介导的cAMP信号传导。使用Epac-S^H187 FRET生物传感器检测显示，当MC4R与MRAP2以1:1或1:4的比例共表达时，α-MSH刺激的cAMP产生浓度-反应曲线出现左移，表明激动剂对MC4R的效力增强。EC₅₀值从4.5 nM降至1.3 nM，且基础活性也显著增加。

MRAP2表达促进Gs招募至MC4R并可能增强α-MSH结合

通过Nb35识别Gas活性构象和miniGs与质膜定位传感器rGFP-CAAX之间的ebBRET分析，证实MRAP2表达促进了Gs蛋白招募。TIRF显微镜显示MRAP2显著增加了纳米抗体招募至膜的动力学速率，使动力学开启速率倍增。同时，单细胞荧光检测发现MRAP2阳性细胞结合更多荧光标记配体（AF647-NDP-α-MSH），放射性配体结合实验显示B_max值增加，表明质膜上受体数量增加。

MRAP2增加MC4R诱导的Gq信号通路激活

研究发现MRAP2同样增强了MC4R对Gq信号通路的激活。通过p63RhoGEF与质膜靶向rGFP之间的ebBRET分析，发现MRAP2共表达使α-MSH刺激的浓度-反应曲线左移，最大反应（E_max）增加，EC₅₀值左移近一个对数单位。IP-One HTRF检测显示，MRAP2以1:4比例共表达时，IP1产生的EC₅₀降低三倍。

MRAP2调节MC4R组成性和配体依赖性内化

研究表明MRAP2显著影响MC4R的细胞定位和运输。共聚焦显微镜显示，当SNAP-MC4R单独表达时，由于受体组成性内化，可见明显的细胞内荧光；而与MRAP2共表达时，细胞内信号大幅减少，表达模式类似于用反向激动剂AgRP处理30分钟后的情况。MRAP2表达显著减少了激动剂刺激后每个细胞中观察到的内体数量，有效损害了受体内化。

MRAP2过表达减少β-arrestin2向受体的招募

研究发现MRAP2显著降低了β-arrestin2的招募。基于生物发光互补（NanoBiT）的检测显示，MRAP2以1:1比例过表达 already导致β-arrestin2招募显著减少。α-MSH刺激后，MRAP2存在下的β-arrestin2招募也减少。BRET实验表明，MRAP2以1:1和1:4比例共表达时，β-arrestin2招募的E_max下降达40%。

MRAP2表达改变MC4R寡聚平衡向单体状态

通过分子亮度单细胞分析发现，MC4R主要以二聚体/寡聚体形式存在，亮度约为单体的1.7倍。而与MRAP2共表达（1:4）导致MC4R寡聚指纹改变，平衡向更单体的群体转移。FCCS数据明确显示SNAP-MC4R与EYFP-MRAP2共扩散，证实了两者间的直接相互作用。

同源二聚化受损MC4R变体的信号传导仍受MRAP2影响

研究人员使用两种同源二聚化受损的MC4R变体（H158R自然变异和ICL2被大麻素1受体（CB₁R）替换的嵌合体）进行实验。发现这两种变体在无MRAP2时显示与野生型MC4R相当的Gs信号传导，而在MRAP2存在下仍显示Gs信号增强。这表明MRAP2对G蛋白的影响主要源于其与protomer的特异性相互作用，而非仅仅通过破坏MC4R同源寡聚体。

MC4R-MRAP2相互作用的推定位点

基于MC2R-MRAP1复合物的结构同源模型预测，MC4R-MRAP2-Gs蛋白复合物的异源二聚体界面可能位于MC4R的跨膜螺旋（TMH）5和6与MRAP2的膜跨越螺旋之间。与MC2R-MRAP1复合物类似，MRAP2的N末端与MC4R的胞外环3（ECL3）、TMH7和N末端可能存在额外相互作用。

研究结论表明，MRAP2通过多种分子机制调控MC4R的细胞功能：增强Gs和Gq/11依赖性下游信号传导，同时减少β-arrestin2招募；调节MC4R细胞运输；改变MC4R寡聚状态；以及对单体形式MC4R仍具有Gs信号增强作用。这些发现揭示了MRAP2如何直接和调节性地影响MC4R，从而代表了MC4R相关功能（如能量消耗和食欲调节）的潜在重要调节器。

讨论部分强调，MRAP2在不同组织/细胞类型中的表达差异或病理条件下可能对MC4R的生物作用产生重要影响。结构模型表明MRAP2与MC4R在TMH5、TMH6和TMH7-ECL3过渡区的潜在相互作用位点，这些区域也是GPCR激活过程中结构重排的热点区域。这种相互作用可能意味着活性状态的保留增加，从而允许更好的G蛋白耦合，同时也可能影响arrestin的空间调整。

该研究为理解MRAP2在调节MC4R介导的控制代谢、饱腹感和交感神经系统的通路中的作用提供了细胞基础，也为测试MRAP1或MRAP2与其他GPCRs信号调节相互作用的概念铺平了道路。这些发现不仅深化了对MC4R信号调控机制的理解，也为肥胖等代谢性疾病的治疗策略开发提供了新的分子靶点和思路。