单次间日疟原虫感染可快速诱导临床免疫保护：一项重复对照人体疟疾感染研究

为解决疟疾临床免疫机制不明确的问题，研究人员开展重复对照人体疟疾感染（CHMI）研究，发现单次间日疟原虫（P. vivax）感染即可诱导快速、持久的临床免疫，显著降低发热和实验室异常（如淋巴细胞减少症、血小板减少症），且该保护作用具有虫种特异性，为疟疾疫苗研发和疾病控制策略提供新方向。

　　

疟疾仍是全球重大健康负担，2023年全球估计有2.63亿病例。在导致人类疟疾的六种寄生虫中，恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）最常导致严重、危及生命的疾病，主要发生在撒哈拉以南非洲5岁以下儿童中。间日疟原虫（Plasmodium vivax）常与恶性疟原虫共流行，在美洲和东南亚地区，超过一半的疟疾发作由它引起。尽管西非和中非大多数人为Duffy血型阴性，因此免受严重的间日疟原虫感染，但间日疟原虫可在Duffy阴性宿主中建立低密度感染，并且有越来越多证据表明它在整个非洲大陆都存在。

疟疾的临床症状，如发热、头痛和疲劳，与全身性炎症的发生相吻合，这导致临床实验室参数异常，包括淋巴细胞减少症和血小板减少症。在25年期间，塞内加尔高传播地区近一半的儿童在童年时期经历了超过50次发热发作，这凸显了疟疾对人类健康的高负担。在人口水平上，疟疾经常是残疾调整生命年的首要原因。在缺乏有效的地方消除途径的情况下，尤其是在中高传播地区，疟疾控制规划需要优先考虑减轻疾病负担。

自然暴露于疟疾会产生临床免疫，从而减少发热并促进无症状感染。临床免疫有两条可能的途径：第一条需要控制寄生虫，将病原体负荷保持在发热阈值以下。在流行地区，这需要多年的暴露，因为它依赖于具有足够广度的抗体反应的演化。第二条是通过宿主适应提高发热阈值，即使在没有寄生虫控制的情况下也能提供临床免疫。对于恶性疟原虫，这被认为是一个相对缓慢的过程；与此一致的是，我们之前发现在对照人体疟疾感染（CHMI）模型中，生命中的前三次感染会引发类似水平的炎症反应和疟疾症状。相反，来自流行地区的证据表明，间日疟原虫感染可以更快地提高发热阈值。对神经梅毒患者疟疾治疗记录的回顾性分析表明，单次间日疟原虫感染可以诱导临床免疫，从而产生跨菌株的发热保护。然而，这些历史研究存在梅毒病原体——梅毒螺旋体（Treponema pallidum）的混杂因素，它会逐步抑制免疫系统以维持自身生存。

我们对疟疾免疫如何发展的知识存在重要空白，这可能阻碍控制这种疾病的努力。目前尚不清楚临床免疫能多快发展以及能持续多久。我们对发热阈值如何在缺乏寄生虫控制的情况下提高的机制理解有限。而且我们尚未在实验感染环境中检查恶性疟原虫和间日疟原虫之间的相互作用。为了填补这些空白，我们开发了一个重复人体疟疾攻击模型，首次在实验医学环境中详细研究间日疟原虫临床免疫的发展。我们表明，单次CHMI后，对间日疟原虫的临床免疫迅速发展，并保护免受与疟疾相关的发热和实验室异常。在重复同源间日疟原虫CHMI期间，炎症细胞因子和趋化因子以及凝血和内皮激活均减弱。对间日疟原虫的临床免疫是在缺乏抗寄生虫免疫的情况下发展的，并且具有寄生虫种特异性——我们未观察到对恶性疟原虫CHMI的任何保护作用。

研究设计与参与者

总共有19名疟疾 na?ve、Duffy血型阳性的成年参与者被纳入并接受了初次间日疟原虫CHMI。其中，12人完成了第二次同源CHMI，2人完成了第三次同源CHMI。根据初步结果，研究方案进行了修订，以研究恶性疟原虫的异源重复CHMI。在VAC069E期间，6名参与者完成了异源恶性疟原虫CHMI：其中3人之前在VAC069D期间完成了初次间日疟原虫CHMI，3人完成了第二次间日疟原虫CHMI。每次CHMI后，参与者被随访最多三个月。

VAC079研究与VAC069同时进行，招募了16名参与者，通过CHMI测试针对间日疟原虫Duffy结合蛋白区域II（PvDBPII）的蛋白/佐剂疫苗的功效。总共有10名参与者在第三次疫苗接种后2-4周完成了三次疫苗接种并接受了初次间日疟原虫CHMI，与未接种疫苗的参与者平行进行。五名参与者接受了第四次疫苗接种，随后在5个月后进行了第二次同源间日疟原虫CHMI，与VAC069D的参与者平行进行。初次CHMI的安全性、免疫原性和功效数据先前已发表。在这里，我们纳入了初次和第二次CHMI的临床数据，以支持VAC069研究的发现。

VAC069和VAC079研究中参与者的人口统计学和Duffy血型表型显示在补充表中。这些在所有接受CHMI的参与者中具有可比性，除了VAC079研究中女性占多数。对于Duffy血型表型为Fy(a+b-)或Fy(a-b+)的参与者，确定了他们的Duffy基因型。在VAC069研究中，一名Duffy表型为Fy(a+b-)的参与者和一名表型为Fy(a-b+)的参与者有一个红细胞沉默的FYBES等位基因（Duffy基因型分别为FYA/FYBES和FYB/FY*BES），这消除了红细胞中Fyb抗原的表达，导致Fy表达水平减半。

在VAC069或VAC079研究中，未发生被认为与CHMI相关的严重不良事件（SAEs）。两项研究中的所有参与者在CHMI后红细胞同种抗体血清检测均为阴性，并且未观察到HIV、乙型肝炎和丙型肝炎、 Epstein-Barr病毒（EBV）或巨细胞病毒（CMV）相对于基线的血清转化。

寄生虫增殖率在初次和第二次CHMI中相当

我们首先询问间日疟原虫PvW1克隆的同源重复CHMI是否会导致寄生虫增殖率（PMR）的降低。所有参与者在初次和第二次CHMI期间均出现了血期寄生虫血症。寄生虫血症的上升和峰值寄生虫血症在第一次、第二次和第三次感染之间相似。初次CHMI（中位PMR=6.4倍 [范围4.0-11.1]）和第二次CHMI（中位PMR=6.0 [范围3.8-8.4]）之间的PMR没有显著差异，并且两名接受第三次CHMI的参与者的PMR相似（8.0和8.7）。初次CHMI期间的PMR在不同Duffy血型表型的个体中相似，尽管两名具有FY*BES等位基因的参与者PMR值低于平均水平。按种族划分的PMR没有明显差异，但结论受非白种人参与者数量少的限制。总之，间日疟原虫CHMI不会产生抗寄生虫 immunity 来减缓或减少再次攻击时的寄生虫生长。再次攻击是使用相同寄生虫克隆的同源攻击，这消除了多态性作为免疫发展的可能障碍。这些结果强化了抗寄生虫免疫是缓慢获得的并且只有在多次血期感染后才会获得的观点。

抗寄生虫免疫被认为是由抗体对血期寄生虫抗原的识别所支撑的，因此我们评估了初次和第二次间日疟原虫CHMI期间相当的寄生虫生长率是否是由于未能产生类别转换的抗体反应。我们使用多重免疫测定法测量针对七种间日疟原虫裂殖子抗原的血清IgG：顶膜抗原1（PvAMA1）、Duffy结合蛋白（PvDBP）、红细胞结合蛋白（PvEBP）、GPI锚定微线体抗原（PvGAMA）、裂殖子表面蛋白1（PvMSP1）、6-半胱氨酸蛋白p12（PvP12）和色氨酸丰富抗原25（PvTRAg25）。初次CHMI后56天可检测到针对PvMSP1的抗体，但在诊断时未在VAC069C的参与者中检测到。完成初次CHMI的参与者对PvAMA1、PvDBP和PvTRAg25的抗体在再次攻击时均得到加强，并且在诊断时已经明显。因此，循环抗体滴度在第二次同源CHMI期间增加，但鉴于初次和重复CHMI期间寄生虫生长动力学相当，这些抗体显然不足以减缓寄生虫生长。

针对PvDBP区域II的抗体有可能通过中断间日疟原虫与网织红细胞上表达的Duffy抗原之间的关键相互作用来阻止裂殖子入侵。PvDBPII是领先的血期候选疫苗抗原，我们先前在VAC079试验中报道，疫苗诱导的150-340μg/mL的抗体反应（通过ELISA测量）可以在初次PvW1血期CHMI后减少间日疟原虫生长约50%。因此，我们询问在CHMI期间是否也自然产生了针对PvDBP区域II的特异性IgG抗体。然而，初次和第二次CHMI后56天，通过ELISA测量的IgG水平仍然无法检测到（<1μg/mL）。另一方面，我们在第二次CHMI后的多重免疫测定中观察到对大的140 kDa全长PvDBP胞外域的小反应。因此，类别转换的针对裂殖子抗原的抗体在单次间日疟原虫再次攻击时产生并得到加强，但缺乏有效中和网织红细胞入侵所需的广度和/或特异性。

单次感染诱导长效临床免疫机制

即使在没有寄生虫控制的情况下也能产生临床免疫，并且在神经梅毒患者中一次疟疾感染后也观察到了这种情况。因此，我们评估了第一次和第二次CHMI之间症状的频率或严重程度是否改变。在VAC069中，所有参与者在初次和第二次CHMI期间均报告了至少一次征集性不良事件（AE）。在初次CHMI期间，征集性AE的频率和严重程度在诊断前后增加，在48小时内达到峰值，并在开始药物治疗后六天内大部分消退。少数参与者报告了与抗疟药相关的AE，这些AE在治疗完成后迅速消退。评估为至少可能与初次CHMI相关的非征集性AE主要为轻度严重程度，食欲下降是最常报告的症状。再次攻击期间任何征集性AE的最大严重程度显著降低，只有1/12（8%）的接受第二次CHMI的参与者报告了至少一次严重（3级）AE，而接受初次CHMI的参与者中有9/19（47%）。最常报告的征集性AE是头痛、疲劳和不适。所有征集性AE在第二次CHMI期间发生的频率和严重程度均低于初次CHMI。

参与者报告的症状是主观的，因此我们评估了可量化的临床和实验室参数的频率和严重程度是否存在可比性的降低。发热（体温>37.5°C）在初次CHMI期间记录在17/19（89%）的参与者中，但在再次攻击时仅记录在1/12（8%）的参与者中。因此，第二次CHMI期间记录的最高体温（中位数=37.2°C）显著低于同一12名参与者在初次CHMI期间（中位数=38.3°C，Wilcoxon符号秩检验p<0.01）。在接受初次CHMI的参与者中，有12/19（63%）观察到丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高（>55 IU L^-1），ALT水平在治疗后六天左右达到峰值，并在攻击后2个月恢复正常。这在三名参与者中是严重的，最高记录的ALT是正常上限的14倍。所有ALT升高的参与者碱性磷酸酶（ALP）和胆红素水平均正常，并且严重转氨酶升高者的凝血测试也保持正常。治疗后第6天，第二次CHMI期间的ALT显著低于初次CHMI，并且仅在1/12（8%）的参与者中在第二次CHMI期间观察到转氨酶升高。值得注意的是，该个体继续出现显著的疟疾症状，并且是唯一一名在第二次和第三次再次攻击时均发热的参与者。与再次攻击期间相比，初次CHMI期间治疗后第1-6天的血清白蛋白也显著降低。

我们在开始抗疟治疗后6天观察到血红蛋白略有下降，但这在初次和第二次CHMI之间没有差异。相反，淋巴细胞减少症很明显，在诊断后24小时达到最低点，并且在再次攻击时显著减弱（线性回归p<0.001）。血小板减少症，同样在治疗后24小时最低，在第二次CHMI期间与初次CHMI相比同样显著减弱（线性回归p<0.001）。总之，这些数据表明，参与者在接受同源重复间日疟原虫CHMI时受到保护，免于发热、肝损伤、淋巴细胞减少症和血小板减少症。与这些结果一致，我们在VAC079研究中也观察到再次攻击后疟疾体征和症状的减少。在VAC079研究中，发热率以及征集性AE和实验室异常（如转氨酶升高）的严重程度在初次CHMI期间与VAC069相似，但在第二次CHMI期间显著降低。非征集性AE，主要为轻度严重程度，在第二次CHMI期间也比初次CHMI报告得少。因此，单次间日疟原虫感染足以产生和维持长效临床免疫机制（本研究中最长20个月），这些机制可以减少后续感染期间疟疾寄生虫造成的损害，并且这些机制独立于抗寄生虫免疫。

临床免疫的基础是炎症减弱

疟疾的许多症状，如发热和实验室异常，包括淋巴细胞减少症，是由宿主对感染的反应引起的。我们假设全身性炎症在再次攻击时会减弱，从而提高发热阈值并改善临床结果。因此，我们使用基于微球的多重蛋白测定法测量了指示炎症、凝血、氧化应激和组织损伤的血浆分析物，并比较了每次感染期间每种分析物随时间变化的动力学。对于这些实验，我们选择了7名在VAC069C接受初次CHMI并在VAC069D接受第二次CHMI的参与者，以及3名在VAC069D接受初次CHMI的参与者。未使用VAC069A或VAC069B的样本，因为未在所有治疗后时间点采集血液样本。

我们发现，主要的致热细胞因子或其调节剂白细胞介素1受体A（IL-1RA）、白细胞介素6（IL-6）和可溶性肿瘤坏死因子受体2（sTNFRII）的血浆水平在初次CHMI期间药物治疗后24小时升高并达到峰值。然而，这些炎症标志物在再次攻击时显著降低。干扰素刺激的C-X-C motif趋化因子配体10（CXCL10）——招募T细胞进入炎症组织的关键宿主因子，以及促进T细胞活化和分化的细胞因子IL-12p70和IL-18，在再次攻击时也减弱。同样，在初次CHMI中诊断后1至3天达到峰值的凝血和内皮激活标志物，在再次攻击时减少，并在第二次CHMI期间和之后保持在几乎基线水平。我们的数据揭示，间日疟原虫可以快速诱导宿主适应，限制炎症，避免促凝血状态，并预防内皮功能障碍，从而提高发热阈值并最大限度地减少与疟疾相关的临床症状。

临床免疫具有寄生虫种特异性

鉴于间日疟原虫在世界大部分地区与恶性疟原虫共流行，我们接下来想评估临床免疫是否对提高发热阈值的寄生虫种类具有特异性。神经梅毒患者有时在对间日疟原虫引起的发热产生耐受后感染恶性疟原虫。因此，我们假设针对间日疟原虫发展的临床免疫对恶性疟原虫的再次攻击无效。为了检验这一假设，我们修订了VAC069E，以感染之前完成过一次或两次间日疟原虫CHMI的参与者，使用恶性疟原虫3D7克隆进行血液攻击。恶性疟原虫优先侵入成熟红细胞，其PMR高于间日疟原虫，后者仅限于网织红细胞。与此一致的是，我们发现在VAC069E中，感染恶性疟原虫的参与者比之前感染间日疟原虫时更快达到治疗阈值。峰值寄生虫血症与初次和第二次间日疟原虫CHMI相当，因此VAC069研究中同源和异源再次攻击之间的任何差异不受循环病原体负荷的混淆。恶性疟原虫生长动力学和达到疟疾诊断标准的时间也与我们之前在使用相同3D7克隆的牛津进行的VAC054和VAC063研究中的初次血期恶性疟原虫CHMI相似。

VAC069E期间的临床症状发生频率和严重程度与初次间日疟原虫CHMI相似，并且与我们之前研究VAC054和VAC063中的初次恶性疟原虫感染相当。VAC069E中经历发热的参与者比例（6人中有2人[33%]）与VAC054和VAC063研究中初次CHMI期间观察到的比例（39人中有23人[59%]）没有显著偏离（Barnards CSM精确检验p=0.3）。在VAC069E期间，当参与者接受第二次间日疟原虫CHMI时减弱的炎症和凝血标志物（包括IL-6、CXCL10和D-二聚体）在异源恶性疟原虫再次攻击期间均再次显著增加。异源恶性疟原虫再次攻击导致明显的淋巴细胞减少症，与初次间日疟原虫CHMI相当，而与初次间日疟原虫CHMI相比，血小板减少症和肝损伤在异源恶性疟原虫再次攻击期间仍然减弱。与我们历史研究VAC054和VAC063中的初次恶性疟原虫CHMI相比，在VAC069E中接受异源恶性疟原虫再次攻击的参与者的淋巴细胞减少症和血小板减少症具有可比性。在我们的历史研究VAC054和VAC063中，未在治疗后第6天（ALT升高峰值时）进行血液测试，因此我们无法将转氨酶升高率与初次恶性疟原虫CHMI进行比较。我们的数据表明，在先前暴露于间日疟原虫后感染恶性疟原虫会导致全身性炎症、发热和淋巴细胞减少，其程度与初次间日疟原虫和初次恶性疟原虫CHMI期间观察到的相当。因此，按症状学定义的临床免疫具有寄生虫种特异性。

讨论

CHMI和再次攻击研究为研究体内自然获得性免疫的机制提供了独特的机会。在这里，我们报告了使用PvW1克隆进行初次和第二次同源间日疟原虫CHMI，随后使用恶性疟原虫3D7克隆进行异源CHMI的安全性、感染性、寄生虫生长动力学和宿主反应。我们表明，同源和异源再次攻击在疟疾 na?ve 成人中是安全的，并且所有参与者在每次接种后都可靠地感染了。

初次和第二次同源间日疟原虫CHMI期间的PMR相当，表明参与者在VAC069研究期间没有发展出有效的抗寄生虫免疫机制。这与我们之前的CHMI研究一致，该研究中参与者在三次感染后显示恶性疟原虫PMR没有变化。这些发现令人惊讶，因为多态性被认为是抗寄生虫免疫发展的主要障碍，但在使用克隆寄生虫的同源再次攻击研究中（如我们的研究中所做的那样）这不是问题。这些结果也与疟疾治疗患者的研究结果不一致，后者经常报告在同源再感染时间日疟原虫和恶性疟原虫的寄生虫血症减少。有效的抗寄生虫免疫可能在CHMI后发展，但持续时间短，并且在我们研究中每次CHMI之间的长时间间隔（在VAC069中长达20个月）内减弱。然而，在疟疾治疗研究中，发现长达96个月的间隔与抗寄生虫免疫的程度没有关系。相反，我们认为缺乏有效的抗寄生虫免疫最好用CHMI研究中应用较低的治疗阈值来解释。VAC069中的最大寄生虫血症比接受疟疾治疗的患者报告的低约1000倍，并且与最近在非人灵长类动物中间日疟原虫再次攻击研究相比也较低。因此，尽管我们在再次攻击时诊断时观察到抗体加强，但参与者可能在体液反应加强到足以影响寄生虫生长之前就接受了药物治疗。或者，CHMI的短持续时间可能产生缺乏有效中和网织红细胞入侵所需的广度和/或特异性的抗体。针对PvDBP区域II的高浓度疫苗诱导抗体能够在CHMI模型中减缓寄生虫生长，但这些抗体在VAC069期间未被间日疟原虫感染以任何显著幅度诱导。

CHMI中缺乏抗寄生虫免疫使我们能够探索独立于病原体负荷运作的临床免疫机制。这些被认为在流行地区非常快速地针对间日疟原虫产生，并支持早期向无症状感染的转变。与此一致的是，我们发现单次CHMI导致对临床症状、发热和实验室异常（包括指示血管渗漏的血清白蛋白降低）的稳健和长效保护。值得注意的是，针对间日疟原虫疟疾这些特征的保护可以在再次攻击前维持长达20个月，并且与全身性炎症、凝血和内皮激活的减弱相吻合。因此，我们可以得出结论，在健康成人中，一次间日疟原虫感染后，发热阈值可以充分提高以产生临床免疫。相反，在我们之前的重复恶性疟原虫CHMI研究中，未观察到接受第二次或第三次同源再次攻击的参与者发热率存在差异。

但是，什么机制可以在单次发作后最大限度地减少炎症并减少损害呢？我们在VAC069中测量的许多炎症标志物是由先天免疫细胞（包括单核细胞和中性粒细胞）以及非免疫细胞（如成纤维细胞）产生的。这些不同的细胞类型不能以与适应性T细胞和B细胞相同的方式获得记忆，而是可能被表观遗传修饰以降低它们对寄生虫及其致热产物的反应性。先天免疫和非造血细胞的表观遗传重编程被称为“先天记忆”，并且已被证明是体外和体内内毒素耐受的基础。此外，单核细胞重编程已被证明可以调节人类脓毒症患者的炎症。那么，疟疾是否同样诱导先天记忆？体外将人单核细胞暴露于寄生红细胞会导致表观遗传修饰和对再刺激的炎症反应减少。类似地，CHMI修饰了炎症基因启动子区域的H3K4me3沉积，导致单核细胞的长期功能变化，这些变化可以在寄生虫清除后持续数周。最近，在乌干达疟疾流行地区生活的儿童的无症状感染被证明与循环单核细胞的表观遗传修饰相关。这些研究评估了疟疾对短寿命终末分化效应器的影响，而长期记忆需要骨髓中祖细胞的表观遗传重编程。因此，未来将CHMI与骨髓取样相结合的研究，如我们正在进行的BIO-004试验（ISRCTN85988131），将使我们能够直接检验先天记忆是疟疾临床免疫基础的假设。我们还将能够研究替代假设，例如疟疾诱导的组织微环境重塑以调节先天免疫细胞功能。

迄今为止，先天记忆的研究主要集中于恶性疟原虫，这提出了关于我们CHMI研究的两个重要问题。如果我们在一次间日疟原虫发作后观察到临床免疫，为什么这在参加我们重复血期恶性疟原虫CHMI试验的参与者中没有诱导？为什么临床免疫具有种特异性，而当引发炎症和发热的寄生虫产物，如DNA和疟色素，是所有寄生虫种类共有的？我们的结果与来自流行地区的观察结果以及疟疾治疗记录的回顾性分析一致，因此我们的观察不太可能是CHMI的假象。相反，这两个问题的答案可能与先天免疫系统识别的寄生虫DNA motif的差异有关。例如，间日疟原虫优先通过CpG motif触发TLR9，而恶性疟原虫基因组更富含AT，并且优先触发cGAS-STING通路。这些差异可能进一步加剧，因为间日疟原虫偏爱骨髓实质，而血期感染的先天免疫反应被认为是在那里引发的。间日疟原虫疟疾如何影响先天免疫细胞？许多炎症标志物在短期和长期内影响先天免疫细胞，而异源CHMI是测试针对不同疟原虫种类的临床免疫的有效方法。值得注意的是，三日疟原虫（Plasmodium malariae）可能保护免受恶性疟原虫侵害，并且开发用于CHMI的三日疟原虫血库为了解临床免疫机制提供了一个诱人的机会。

VAC069研究的主要限制是研究中剩余进行重复CHMI的参与者数量少，19人中有12人接受了两次间日疟原虫感染，只有两名参与者完成了第三次同源攻击。六名参与者在一次或两次先前间日疟原虫感染后接受了异源恶性疟原虫再次攻击。这主要是由于COVID-19大流行期间试验显著暂停，这也导致每次CHMI之间的时间间隔更长且更可变（5-20个月）。然而，临床免疫在单次间日疟原虫感染后一致发展，无论每次CHMI之间的时间间隔如何，并且在VAC079研究中也观察到。重要的是，对于那些返回和不返回进行再次攻击的参与者，第一次间日疟原虫感染期间经历的症状没有显著差异。自我报告症状可能存在偏倚，因为随机化、纳入安慰剂对照或盲法在本研究中不可行。然而，我们使用客观措施评估了临床免疫，包括发热减少和实验室异常如淋巴细胞减少和转氨酶升高。此外，炎症反应在重复CHMI期间显著减弱。最后，这些结果最好在通过蚊子叮咬进行间日疟原虫再次攻击的研究中复制，尽管复发风险可能限制这项未来工作的可行性。

我们仍然缺乏所有必要的工具来追求广泛根除恶性疟原虫和间日疟原虫，因此疾病控制规划可能在未来几年处于公共卫生政策的前沿。在这里，我们表明，单次间日疟原虫感染诱导长效临床免疫，可以在缺乏有效抗寄生虫免疫的情况下预防疟疾发热和症状。这为在实验环境中剖析疟疾临床免疫的机制奠定了基础，并可能加速开发专门降低疟疾临床严重程度和发病率的干预措施。

主要关键技术方法

本研究采用了多项关键技术方法：1) 对照人体疟疾感染（CHMI）模型，使用静脉注射冷冻保存的间日疟原虫PvW1克隆或恶性疟原虫3D7克隆感染的红细胞；2) 定量聚合酶链反应（qPCR）动态监测寄生虫血症并计算寄生虫增殖率（PMR）；3) 多重免疫测定（Luminex）检测针对7种间日疟原虫裂殖子抗原的血清IgG抗体水平；4) 酶联免疫吸附测定（ELISA）定量抗PvDBPII抗体；5) 定制多重蛋白分析（LEGENDplex）定量25种血浆炎症、凝血和内皮功能相关生物标志物；6) 常规血液学（全血细胞计数）和生物化学（肝肾功能）检测。研究队列为英国牛津大学招募的疟疾 na?ve、Duffy阳性健康成人志愿者。

研究结果

研究设计与参与者

总共有19名参与者接受了初次P. vivax CHMI，其中12人完成了第二次同源CHMI，2人完成了第三次同源CHMI。6名参与者随后接受了异源P. falciparum CHMI。所有参与者均成功感染，未发生与CHMI相关的严重不良事件。

寄生虫增殖率在初次和第二次CHMI中相当

研究发现初次和第二次P. vivax CHMI的寄生虫增殖率（PMR）无显著差异（初次中位PMR=6.4，第二次中位PMR=6.0，p=0.2），表明未产生有效的抗寄生虫免疫。尽管针对多种裂殖子抗原（如PvAMA1、PvDBP、PvTRAg25）的IgG抗体在再次攻击时得到加强并升高，但这些抗体不足以减缓寄生虫生长。针对关键疫苗候选抗原PvDBPII的抗体水平在感染后仍低于检测限。

单次感染诱导长效临床免疫机制

临床症状和体征在第二次CHMI期间显著减轻。严重不良事件（AE）发生率从初次CHMI的47%降至第二次的8%。发热（>37.5°C）发生率从89%降至8%，最高体温显著降低（p<0.01）。实验室异常也显著改善：转氨酶（ALT）升高发生率从63%降至8%，低白蛋白血症、淋巴细胞减少症和血小板减少症的程度均显著减弱（线性回归p<0.001）。这表明单次P. vivax感染即可诱导快速、持久的临床免疫，保护宿主免受疾病严重表现。

临床免疫的基础是炎症减弱

多重蛋白分析显示，第二次CHMI期间全身