基于自适应光学与单物镜光片成像的深度单分子定位显微技术soSMARt实现三维纳米尺度解析

本研究针对单分子定位显微镜(SMLM)在深度成像中面临的光学像差、机械漂移和三维重建等关键问题，开发了soSMARt技术平台。通过创新性微加工器件集成45°微镜和荧光基准标记，结合自适应光学(AO)校正和实时反馈漂移校正系统，成功实现了全细胞尺度三维超分辨率成像。该技术突破性地将轴向分辨率提升至40.5±1.5nm， lateral分辨率达7.0±0.4nm，并成功应用于细胞核膜、线粒体网络和膜受体分布的纳米尺度研究，为复杂生物体系的三维纳米结构解析提供了强大工具。

　　

在生物医学研究领域，揭示生物分子在原生环境中的纳米尺度组织与动态过程一直是科学家追求的目标。单分子定位显微镜(Single Molecule Localization Microscopy, SMLM)的出现极大地推动了这一领域的发展，使研究人员能够以前所未有的分辨率观察生物分子的排列和运动。然而，尽管SMLM因其卓越性能和相对简单的仪器配置很快被科学界采用，但其在深度成像能力方面仍存在明显局限，这限制了许多重要生物学过程的研究。

传统SMLM技术如TIRF(全内反射荧光显微镜)和HILO(高倾斜薄片照明)虽然能提供较高的信噪比和较低的背景噪声，但只能观察玻璃盖玻片附近区域的生物分子，无法实现全细胞尺度或更深层次组织的研究。而传统的光片荧光显微镜(Light-Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM)虽然适合厚样品成像，但其多物镜配置限制了收集物镜的数值孔径(NA)，从而影响了SMLM的定位性能。

深度成像面临的挑战主要包括三个方面：机械漂移校正、整个纳米尺度体积的重建以及随成像深度增加而增强的光学像差。特别是在使用基于点扩散函数(Point Spread Function, PSF)整形的三维定位方法时，光学像差会严重 distort PSF，导致定位精度和准确性的损失。

为了解决这些挑战，由Marine Cabillic和Hisham Forriere共同领导的研究团队开发了一种称为soSMARt(single-objective Single Molecule Active Registration technique)的解决方案，能够在整个细胞体积内进行三维SMLM成像。这项研究成果发表在《Nature Communications》期刊上，为纳米尺度生物学研究提供了新的技术平台。

研究人员主要通过以下几个关键技术方法开展研究：首先开发了专用的SMARt微加工器件，这些器件包含45°微镜和嵌入荧光纳米金刚石基准标记的微孔；其次建立了结合自适应光学(AO)的soSPIM(单物镜选择性平面照明显微镜)成像系统，用于像差校正和PSF校准；采用DNA-PAINT(点积累纳米级地形成像)技术实现光漂白-free成像；利用自主开发的SMARtrack软件进行实时三维纳米级漂移校正；应用深度学习算法DECODE进行高密度单分子定位以缩短采集时间；最后使用Point-Cloud Analyst(PoCA)软件进行纳米尺度定量分析。

深度依赖像差表征与校正

研究人员首先系统地表征了深度依赖的光学像差。通过将0.1μm荧光微珠嵌入低熔点琼脂糖凝胶中，使用相位恢复方法评估不同深度(0-40μm)的PSF像差情况。研究发现，除了故意引入的垂直像散用于三维定位外，大多数像差随深度保持稳定，但第三和第五阶球差随深度增加而线性增加，斜率为0.031±0.003 rad.μm^-1。深度依赖像差特别是球差会降解像散信号，影响单分子轴向定位的准确性。通过基于最大强度度量的3N算法校正一级像差，可以在深度达45μm时部分恢复斜率，提高定位精度。

实时三维纳米级漂移校正

针对SMLM中的漂移校正问题，研究团队开发了实时三维纳米级漂移校正方法。SMARt器件中均匀嵌入了光稳定性强的荧光纳米金刚石基准标记(密度为(4.5±3.1)×10^-3 beads per μm³)， combined with SMARtrack软件实现了基于反馈循环的实时漂移校正。该系统轴向校正精度达到12.9±1.6nm， lateral精度为6.4±0.3nm，优于尼康完美聚焦系统(PFS)的16.6±4.7nm(仅轴向校正)。SMARtrack还能自动选择每个平面的基准标记，确保整个采集过程中激发平面和检测平面保持重合。

深度三维SMLM成像

研究人员使用DNA-PAINT成像技术对悬浮在SMARt器件微孔中的COS7细胞核膜(Lamin B1)进行了深度三维SMLM成像。在距盖玻片13.5μm处获取30,000帧图像(约50分钟)，通过297,736个定位点重建了1000nm厚的光学切片。傅里叶环相关(FRC)估计的空间分辨率为31nm，核膜厚度测量为79±2nm(径向)和183±2nm(轴向)。在30μm深度进行的对比实验表明，深度依赖像差会显著降解PSF，降低重建准确性并产生 artifacts，而通过变形镜(DM)校正这些像差能够恢复PSF完整性，提高三维重建质量。

自动体积三维SMLM

soSMARt技术实现了全细胞(10μm厚)的自动采集。光片照明与DNA-PAINT的结合实现了低背景的逐平面序列采集，同时避免了荧光团的光漂白问题。通过SMARt器件中的纳米金刚石标记，能够在细胞深度校正光学像差，实现准确的三维单分子定位。结合SMARtrack主动反馈漂移校正，能够进行长期无漂移的DNA-PAINT序列采集。

研究人员首先采集了COS-7细胞中线粒体网络的三维图像，厚度为3μm，6个平面(间隔400nm)， 8000帧/平面，从162,726个过滤后的定位点进行重建。整个采集过程约3小时，重建图像的空间分辨率经FRC估计为55±3nm(径向)，通过基准标记定位测得横向分辨率为11.4±0.5nm，轴向为49.3±2.8nm。

随后采集了COS-7细胞Lamin B1核膜的整个体积，35个平面(间隔350nm)， 10,000帧/平面，从618,187个三维定位点进行重建。整个过程约16小时，沿轴向方向的定位点分布相对均匀(变异系数56%)。三维重建清晰显示了核周围Lamin皮层的完整形状和斜率，横向分辨率经FRC估计为78±3nm，通过基准标记测量横向分辨率为7.0±0.4nm，轴向为40.5±1.5nm。

膜受体纳米尺度分布研究

为了验证soSMARt技术在定量分析中的应用能力，研究人员研究了悬浮Jurkat T细胞表面PD-1和CD3膜受体的纳米尺度分布。使用前述protocol，采集了三个10μm厚的三维DNA-PAINT序列，每个包含25-40个平面(间隔300-400nm)， 10,000-15,000帧/平面。重建生成自154,606(JPD1)和512,353、634,073(CD3)个三维定位点。

使用基于曲面细分的分析软件PoCA进行纳米尺度定量分析，量化了簇特性(局部密度、横向和轴向扩展、体积、定位点数)及其在Jurkat T细胞表面的空间分布。测量得到PD-1(相应为CD3)簇的平均横向尺寸(FWHM)为50.5±0.4nm(n=1,086)(相应为56.3±0.5nm(n=1,853)和64.9±0.7nm(n=1,575))，平均轴向尺寸为119±2nm(相应为109±2nm和128±2nm)。这些定量参数沿z轴的均匀分布说明了整个采集体积的数据质量均匀性。

基于高密度SMLM的快速体积三维SMLM

为了克服三维SMLM采集时间长的限制(数小时至数天)，研究人员将最新的基于深度学习的高密度定位方法DECODE与体积成像方法相结合。DECODE依靠真实的PSF模型模拟训练卷积神经网络，能够在重叠条件下预测单发射体的三维位置，性能优于任何其他现有的基于模型的方法。

使用较高浓度的imager(2.5nM compared to标准条件的0.2-0.8nM)，采集了20个平面(间隔500nm)的整个细胞(LaminB1标记)，每平面仅2000幅图像。使用1.9M个定位点成功重建了整个细胞，仅需1.5小时，空间分辨率经FRC估计为42±1nm，通过基准标记测量横向分辨率为10.0±0.2nm，轴向为41.2±0.9nm。这与标准实验相比加快了约十倍，与之前发表的 whole cell单分子超分辨率成像工作一致。但研究人员注意到重建中出现 systematic网格图案 artifacts，与相机像素大小完全对应，通过简单的傅里叶滤波可以减弱这种网格伪影。

三维细胞培养中的体积SMLM成像

利用soSPIM成像系统的光学切片能力和高光子收集效率，研究人员进行了概念验证实验，证明在三维细胞培养中进行体积SMLM的可行性。三维细胞培养(如球体或类器官)是模拟真实器官或肿瘤结构和功能的器官型系统，在基础研究、药物毒性和个性化医疗中具有巨大应用前景。然而，其尺寸使得荧光成像特别是超分辨率成像非常具有挑战性。

研究人员使用专门为三维细胞培养和soSPIM成像设计的JeWells器件(截顶金字塔形孔，具有45°反射壁)。在含有数百个100μm高JeWells(顶部开口70μm)的器件中培养HepG2癌细胞5天形成肿瘤球体(约100μm直径)。固定后对球体核膜(Lamin B1)进行DNA-PAINT标记，全核用DAPI染色。

采集距盖玻片30μm处的12个平面(间隔500nm)，每平面5000帧，从中定位单分子事件并重建三维超分辨率体积，平均空间分辨率经FRC估计为54±1nm。通过高斯拟合强度剖面测量核膜厚度为138±13nm(FWHM)。由于Jewells目前不允许在所有深度整合基准标记，轴向漂移使用显微镜的PFS实时校正，横向漂移通过ThunderSTORM的图像互相关进行后采集校正。

研究结论与意义

soSMARt技术平台的开发成功解决了深度SMLM成像中的关键挑战，实现了在完整细胞体积内进行 aberration-free的三维超分辨率成像。该技术通过专用SMARt器件、自适应光学和SMARtrack反馈循环漂移校正系统的结合，将轴向分辨率提升至40.5±1.5nm，横向分辨率达7.0±0.4nm，代表了单分子显微镜领域的重大技术进步。

该研究的重要意义在于：首先，soSMARt提供了自动化单分子采集和重建 over扩展体积的能力，具有长期纳米级样品稳定性；其次，开启了在大型三维体积中进行定量SMLM的新可能性，特别是在免疫治疗应用特别关注的膜受体(如CD3和PD-1)纳米分布研究方面；第三，采集过程的自动化 combined with soSPIM器件的独特并行化能力(单个SMARt器件可容纳数百个 identical且良好对齐的微孔)，为研究治疗性抗体纳米尺度效应的新一代筛选平台铺平了道路。

SMARt微孔的尺寸可扩展以适应各种生物样品，从分离细胞和小型细胞聚集体到更复杂的三维细胞培养物如球体或类器官。soSMARt平台还兼容活细胞成像和单粒子追踪，器件制造中使用的聚合物完全生物相容， previous研究已证明使用类似器件对培养数天并粘附于孔壁的细胞进行成像的可行性。

对于SMLM最具挑战性 yet最具转化潜力的目标是在复杂三维细胞培养(如球体、类器官或组织外植体)中的应用，研究人员通过使用JeWells器件证明了soSPIM在此类三维细胞培养中执行三维SMLM的能力。未来，实现与单细胞相当质量的三维样品SMLM将需要实施新的像差校正策略，利用单分子信号本身或额外的 bulk荧光标记，并考虑等晕补片大小以校正整个视场中空间变化的像差。

减少采集时间也至关重要，因为传统SMLM固有的慢采集速度仍然是研究大生物样品的主要限制。基于深度学习的计算方法如DECODE有望将采集时间减少一个数量级，但为了充分发挥其潜力并避免重建伪影，需要 significant努力用于卷积神经网络训练的PSF和背景的准确 realistic建模。

soSMARt中实现的主动反馈循环注册 clearly展示了将智能显微镜集成到SMLM中以增强其性能的潜力。这一概念可扩展到几个有前景的方向，包括自动细胞筛选、罕见细胞表型检测、活体识别特定感兴趣事件以及单分子数据的实时分析， coupled with光学像差的自动估计以实现基于AO的实时校正。

总之，soSMARt技术为纳米尺度生物学研究提供了强大的新工具，使研究人员能够在完整细胞和复杂生物系统中以纳米级分辨率探索生物分子的三维组织和动态过程，对细胞生物学、发育生物学和生物医学研究具有深远影响。