CD103-CD8+ T细胞通过Granzyme K-PAR-1信号通路促进阿尔茨海默病神经毒性炎症

本研究揭示了阿尔茨海默病（AD）中CD103-CD8+组织驻留记忆T细胞（Trm）通过Granzyme K（GrK）-蛋白酶激活受体1（PAR-1）信号轴诱导神经元功能障碍和tau蛋白过度磷酸化的新机制。研究人员发现该细胞亚群通过LFA-1整合素介导的迁移途径从外周循环浸润大脑，其产生的GrK通过激活神经元PAR-1受体引发钙信号紊乱。该研究为AD免疫治疗提供了新的靶点，发表于《Nature Communications》。

　　

阿尔茨海默病作为影响全球超过3200万人的神经退行性疾病，其发病机制中免疫系统的作用日益受到关注。虽然β淀粉样蛋白（Aβ）沉积和tau蛋白过度磷酸化等经典病理特征已被广泛研究，但适应性免疫细胞特别是CD8⁺ T细胞在疾病进展中的具体作用仍不明确。近年研究表明，CD8⁺ T细胞在AD患者和模型动物大脑中均有浸润，且与年龄相关的脑衰老过程中CD8⁺ T细胞积累可促进轴突变性，但这些细胞如何与神经元相互作用并影响AD病理进程仍需深入探索。

针对这一科学问题，Eleonora Terrabuio等研究人员在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。他们发现AD患者和3xTg-AD小鼠模型的大脑CD8⁺ T细胞区室存在显著失调，主要表现为产生大量颗粒酶K（Granzyme K, GrK）的活化CD103^-组织驻留记忆T细胞（Tissue-resident memory T cells, Trm）的积累。这些细胞起源于外周循环，通过LFA-1整合素介导的迁移机制进入大脑，进而通过GrK-PAR-1信号轴诱导神经元功能障碍和tau蛋白过度磷酸化。

研究团队综合运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术、免疫荧光染色、钙成像技术、蛋白质组学分析以及行为学实验等多种技术手段。通过对8只3xTg-AD和8只野生型（WT）小鼠的脑组织和脑膜CD45^HIGH白细胞进行scRNA-seq分析，鉴定出3,098个CD8⁺ T细胞（占19.06%），并进一步划分为5个功能亚群。研究还分析了已发表的人类scRNA-seq数据集（GSE134578和GSE181279），验证了在AD患者中的发现。通过体内抗体耗竭实验、基因敲除小鼠模型（3xTg-AD/Itgal^-/-）以及体外神经元与T细胞共培养系统，深入探究了CD103^-CD8⁺ Trm细胞的起源、迁移机制及其神经毒性作用。

CD103^-CD8⁺ Trm细胞在3xTg-AD小鼠大脑中积累

scRNA-seq分析显示，3xTg-AD小鼠大脑中CD8⁺ T细胞区室发生显著改变，CD103^- Trm细胞比例从WT的45.9%增加至73.69%，而CD103⁺ Trm细胞则从27.44%减少至9.8%。这种变化具有组织特异性，脑膜中未观察到显著差异。基因表达分析发现，与CD103⁺ Trm细胞分化和维持相关的转录因子（Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Smad4、Smad6、Smad7和Smad9）和细胞因子（Il15、Il7、Tgfb3、Tgfb2、Tgfb1、Il21、Tnf和Il33）基因表达下调，而抑制CD103⁺CD8⁺ T细胞表型的S1pr1基因表达上调。

脑CD103^-CD8⁺ T细胞显示与AD强相关的活化表型

基因集富集分析（GSEA）显示，3xTg-AD小鼠大脑中"神经退行性疾病通路"、"阿尔茨海默病"和"亨廷顿病"是最富集的术语。CD103^-CD8⁺ Trm细胞与AD通路呈正相关，而CD103⁺CD8⁺ Trm细胞呈负相关。生物学过程基因本体（BP-GO）分析显示，CD103^-CD8⁺ Trm细胞富集于"免疫系统过程"（GO:0002376）、"免疫系统过程调控"（GO:0002682）、"氮化合物运输"（GO:0071705）和"水解酶活性"（GO:0016787）等与T细胞活化和细胞毒性颗粒分泌相关的通路。

脑CD103^-CD8⁺ Trm细胞产生颗粒酶K

Gzmk基因在CD103^-CD8⁺ Trm细胞中高表达，而其他颗粒酶（Gzma和Gzmb）和穿孔素-1（Prf1）基因表达水平较低。流式细胞术验证了CD103^-CD8⁺ Trm细胞低表达GrA和GrB但高表达GrK蛋白。重要的是，3xTg-AD小鼠大脑中Gzmk表达上调，86%的CD103^-CD8⁺ Trm细胞产生GrK，而CD103⁺群体中比例较低。

GrK⁺CD103^-CD8⁺ Trm细胞通过GrK-PAR-1轴诱导神经元功能障碍

免疫荧光染色显示，3xTg-AD小鼠海马神经元附近存在GrK⁺CD8⁺ T细胞，而WT大脑中CD8⁺ T细胞GrK表达较低。共培养实验发现，与GrK⁺CD103^-CD8⁺ Trm细胞接触的原代神经元细胞内钙（Ca²⁺）水平显著升高，而CD103⁺CD8⁺ Trm细胞无此效应。纯化的活性GrK以剂量依赖方式直接诱导细胞内Ca²⁺释放。PAR-1抑制剂SCH79797显著降低GrK⁺CD103^-CD8⁺ Trm细胞引起的神经元内Ca²⁺释放，并剂量依赖性地抑制GrK诱导的Ca²⁺释放。

脑CD103^-CD8⁺ Trm细胞起源于循环并对3xTg-AD小鼠有害

抗CD8抗体处理显著减少3xTg-AD小鼠大脑CD103^-CD8⁺ Trm细胞数量，但不影响CD103⁺CD8⁺ Trm细胞，表明CD103^-细胞从血液补充。行为学实验显示，CD8⁺ T细胞耗竭改善3xTg-AD小鼠认知功能：莫里斯水迷宫（MWM）测试显示训练期间学习曲线改善，探测试验显示平台搜索更积极，路径效率提高，身体旋转减少；情境恐惧条件反射（CFC）测试显示冻结反应百分比增加。神经病理学分析发现，CD8⁺ T细胞耗竭降低海马Aβ负荷和tau过度磷酸化水平，而不影响总tau水平。ELISA和点印迹实验证实脑匀浆可溶性和不溶性部分中Aβ_1-40、Aβ_1-42沉积以及tau过度磷酸化（pT231, AT180）减少，不溶性寡聚体（A11抗体）和纤维状（OC抗体）Aβ形式减少。

LFA-1整合素介导CD103^-CD8⁺ T细胞向脑浸润

流式细胞术显示3xTg-AD小鼠血液中LFA-1⁺循环CD8⁺ T细胞比例和平均荧光强度（MFI）增加。将3xTg-AD小鼠与Itgal^-/-小鼠杂交获得3xTg-AD/Itgal^-/-小鼠，发现大脑CD103^-CD8⁺ Trm细胞比例显著降低，海马Aβ负荷和tau过度磷酸化（AT180）减少，总tau水平无变化。对人类scRNA-seq数据集（GSE181279）分析发现，AD患者循环CD8⁺ T细胞中ITGAL（编码LFA-1的CD11a亚基）表达上调，特别是在Tem亚群中。

产生GrK的CD8⁺ T细胞在AD患者脑脊液和大脑中积累

分析人脑脊液免疫细胞scRNA-seq数据集（GSE134578）发现，CD8⁺ T细胞可分为CD69⁺和PRDM1⁺ Trm细胞以及KLF2表达CD8⁺ T细胞。Trm群体可进一步分为表达GZMK和S1PR1的CD103^- CD8⁺ Trm细胞和表达CD7、ITGA1、KLRB1和CCR6的ITGAE表达CD103⁺ CD8⁺ Trm细胞。疾病进展过程中CD103^-CD8⁺ Trm细胞增加而CD103⁺CD8⁺ Trm细胞减少。AD患者CD103^-CD8⁺ Trm细胞中GZMK表达显著高于健康对照和轻度认知障碍（MCI）患者。免疫荧光染色显示，AD患者海马中存在脑实质内和血管内GrK⁺CD103^-CD8⁺ T细胞，靠近海马神经元，而对照组中主要为GrK^-CD103^-CD8⁺ T细胞。定量分析显示AD患者海马中脑实质内GrK⁺CD103^-CD8⁺ T细胞数量显著增加。

GrK-PAR-1信号在人神经元细胞中诱导功能改变和tau过度磷酸化

分化的人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞用纯化GrK处理，在PAR-1抑制剂SCH79797存在或不存在情况下测量细胞内Ca²⁺释放。GrK单独处理显著增加细胞内Ca²⁺释放，而GrK与SCH79797共培养细胞Ca²⁺水平与阴性对照相当。重组GrK单独处理显著增加tau蛋白丝氨酸残基（pS199和pS396）的过度磷酸化，但不影响苏氨酸（pT231）磷酸化，而SCH79797阻止丝氨酸残基的tau过度磷酸化。总tau蛋白水平无变化。蛋白质组学分析显示，GrK处理显著增加84种蛋白质丰度，包括参与AD发展的蛋白质。通路富集分析显示"阿尔茨海默病/神经退行性变"和"激酶通路"簇最富集。"阿尔茨海默病/神经退行性变"簇中最显著富集的通路包括"淀粉样纤维形成"、"神经退行性疾病"和"CDK5失调触发多种神经退行性变"。"激酶通路"簇特征为与MAP激酶激活相关的通路上调，MAP激酶介导tau过度磷酸化，以及"翻译后蛋白磷酸化通路"。GrK还诱导"NF-κB信号"上调，在神经元中与离子通道蛋白表达调节和更高Aβ负荷相关。所有这些通路的诱导在GrK与SCH79797共同处理时被阻止。

本研究系统揭示了CD103^-CD8⁺ Trm细胞在AD发病机制中的关键作用。这些细胞从外周循环募集，通过LFA-1整合素依赖机制浸润大脑，通过产生GrK激活神经元PAR-1受体，导致细胞内钙信号紊乱和tau蛋白过度磷酸化。研究首次建立了免疫细胞与神经元之间直接通讯的病理机制，为理解AD中神经免疫相互作用提供了新视角。GrK-PAR-1信号轴的发现不仅解释了CD8⁺ T细胞如何直接促进tau病理，也为AD治疗提供了新的靶点。针对GrK的抑制剂和靶向PAR-1的药物已有开发用于其他疾病，这为快速转化到临床应用提供了可能性。该研究强调了免疫系统与中枢神经系统之间失调的通讯在AD发展中的重要性，为开发针对免疫介导的神经毒性炎症的新疗法奠定了理论基础。