探索Aminobacter niigataensis MSH1与Piscinibacter sp. K169协同降解饮用水中2,6-二氯苯甲酰胺（BAM）的边界条件：细胞密度与有机碳的作用

本综述系统探讨了在饮用水处理厂（DWTP）砂滤池中，利用Aminobacter niigataensis MSH1与Piscinibacter sp. K169的协同互作提升2,6-二氯苯甲酰胺（BAM）生物降解效率的关键边界条件。研究揭示了初始细胞密度（低至104 cells/mL以下会破坏合作）和砂基质固有有机碳（而非外源乙酸）对维持互作的决定性作用，为优化生物强化（bioaugmentation）策略提供了实验依据，具有重要的环境生物技术应用价值。

　　

边界条件对利用Aminobacter niigataensis MSH1与Piscinibacter sp. K169合作支持饮用水处理砂滤池中2,6-二氯苯甲酰胺生物降解的影响：细胞密度和有机碳的作用

摘要

2,6-二氯苯甲酰胺（BAM）作为一种除草剂双氯苯腈（dichlobenil）的转化产物，是地下水中频繁检测出的微污染物，对饮用水处理厂（DWTPs）构成重大挑战。Aminobacter niigataensis MSH1是一种能够好氧矿化低浓度BAM的细菌土壤分离株，已被提议用于生物强化DWTPs中的过滤单元（如快速砂滤池）以避免BAM污染。尽管在实验室和中试砂滤器中，MSH1的生物强化成功地将BAM从0.2 μg/L降至法定饮用水阈值0.1 μg/L以下，但BAM生物降解随时间恶化，这与MSH1细胞密度和活性的下降有关，可能归因于寡营养目标环境中碳和能源的限制。

最近，提出将MSH1与源自目标环境（即寡营养DWTP砂滤池）并支持降解菌活性的生物共接种，作为改进生物强化的一种方法。Vandermaesen等人鉴定了DWTP砂滤池驻留细菌，如Piscinibacter sp. K169，它在模拟砂滤环境的砂微宇宙中改善了MSH1的BAM矿化活性，并在人工组装的高丰富度群落中压制了其他高度拮抗砂滤池驻留细菌的负面影响。这种所谓的受益菌株显然通过与MSH1的协作互动来支持其BAM矿化活性。系统发育上，Piscinibacter sp. K169与Piscinibacter aquaticus最相关，后者是一种在寡营养水域中繁盛的生物，表明其适应寡营养环境，并且可能容易在其起源栖息地（即砂滤环境）中定殖。有趣的是，MSH1的存在增加了砂滤微宇宙中K169的细胞密度，表明两种菌株之间的协作互动扩展到一种兼性互惠互动，双方都受益（即K169积极影响MSH1中的BAM矿化，而MSH1增加K169的细胞密度）。

虽然MSH1与受益菌K169之间相互作用的确切机制尚不清楚，但其明显的协作特性可能导致两种菌株同时局部微尺度生长，这将通过将它们的适应性联系在一起、扩展它们的生态位并与竞争者创造空间分离来进一步支持两个伙伴之间的共存。为了将诸如MSH1/K169伙伴关系的种间共培养系统引入并建立到目标系统中，必须确定 consortium 伙伴的合适接种密度和合适生长条件。两个伙伴的初始种群大小及其比例预计会影响最终的群落结构，从而影响伙伴生物之间的相互作用，例如通过影响营养物、辅因子和信号分子交换的效率，这些是协作互动的主要机制。尽管实验研究对此进行了检验，但很少且很少系统地实施于环境生物技术相关的协作细菌伙伴关系。

类似地，理论建模和实验研究表明，两种微生物物种之间的相互作用，无论是协同还是竞争，都可以通过由多种环境因素（包括非生物（例如营养物包括碳源、毒素、温度、pH和氧气）和生物（例如细菌、植物和食草动物）因素）决定的生态位条件间接介导和影响。然而，再次强调，专注于环境协作联盟的实验研究，尤其是那些具有生物技术相关性的研究，很少见。就MSH1/K169伙伴关系而言，砂滤微宇宙中可用的有机碳源为两种菌株提供了生态位，因此任何补充的底物（如乙酸盐，在先前的研究中外部添加到砂滤微宇宙中）以及砂上固有和由砂提供的碳源可能在MSH1和K169之间的相互作用中发挥作用。因此，为了在真实的生物强化背景下应用“共接种”概念，例如MSH1与K169组合，确定理想的接种密度以及驱动合作的碳源是关键先决条件。

本研究旨在获得对（i）MSH1和K169之间成功合作的约束条件，特别是MSH1和K169的初始细胞密度和（ii）控制MSH1和K169之间协作互动的环境因素（重点关注碳/能源资源的作用）的理解。为此，进行了单种和双种砂滤微宇宙实验，如所述但修改和变化条件。在前两个实验中，我们改变了一种或两种菌株的初始细胞密度，以检查细胞密度比和细胞密度的影响。在另外两个实验中，我们检查了碳源的作用。我们首先改变了在早期实验中作为碳源外部添加的乙酸盐浓度。在第二个实验中，我们检查了实验装置中使用的砂上固有碳的作用。

材料与方法

使用MSH1-GFP，一种携带GFP-2X-miniTn5Km基因盒的A. niigataensis MSH1的GFP标记变体。使用Piscinibacter sp. K169的利福平抗性变体（即K169-RIF）。标准微宇宙实验在96孔深板中进行，包含150 mg洗涤灭菌的砂（1-2 mm粒径），如先前所述。简而言之，孔中的砂用100 μL在最小培养基MMO中洗涤并重悬的细菌培养物接种，其中含有150 μg/L乙酸钠，细胞密度为10⁷ cells/mL（每种菌株），作为单种（R_T = 1）或双种（R_T = 2）系统，四个重复。在所谓的竞争阶段（即在20°C下孵育7天 [t₇]）之后，添加5,000计数每分钟（cpm）[环-U?¹⁴C]标记的BAM以确定BAM矿化。同时设置相同处理的砂滤微宇宙于96孔深板中（四个重复）以确定MSH1和K169细胞密度。包括无菌非生物对照，即无细菌的微宇宙。检查不同初始MSH1/K169细胞密度和细胞密度比影响的微宇宙设置与标准微宇宙相同，但MSH1和K169的细胞密度不同，名义范围在10⁷和10³ cells/mL之间（四重复）。为了测试添加的乙酸盐浓度的影响，如标准条件，孔中的砂用100 μL在MMO培养基中的细菌悬浮液接种，细胞密度为10⁷ cells/mL（每种菌株），但添加了不同浓度的乙酸钠（即0、50和100 μg/L）以及标准浓度150 μg/L。对于每个乙酸盐浓度，测试了双种组装MSH1 + K169和仅包含MSH1或K169的单种系统（四重复）。为了揭示砂基质和砂上存在的有机碳的作用，设置了四重复微宇宙，类似于标准微宇宙，但有和没有砂基质，有缺乏有机碳的砂，以及有从砂中提取的有机碳。不添加乙酸盐。通过在550°C的马弗炉中马弗处理砂5小时获得缺乏有机碳的砂。通过将30 g洗涤灭菌的砂和20 mL MMO培养基在马弗处理的玻璃小瓶中在50 rpm的试管旋转器上混合8小时，从砂中提取有机碳。通过0.45 μm过滤器过滤将溶解有机碳（DOC）提取物与砂粒分离。如使用TOC分析仪测定，DOC提取物含有37.1 mg C/L的有机碳，并用于重悬K169/MSH1细胞以接种在没有和有马弗处理砂的孔中。如所述测定t₇时的BAM矿化和细胞密度。在130小时内19个时间点（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、7、8、9、11、12、16、26、55和130小时）跟踪BAM矿化，并将累积百分比¹⁴CO₂相对于添加的总¹⁴C量绘制为孵育时间的函数。使用修正的Gompertz模型从曲线获得BAM矿化动力学参数λ、μ和A。使用MATLAB R2012b中的Lsqnonlin命令确定动力学参数。参数c始终接近零。如之前所做，使用λ和μ对K169对MSH1的影响和相互作用的性质（积极、中性或消极）在K169朝向MSH1的方向上进行评分。与MSH1单种系统相比，双种系统中λ显著（95%显著性水平）降低和/或μ增加表明积极影响，而λ显著增加和/或μ降低评为消极相互作用。对λ和μ没有影响定义为中性相互作用。A不用于该目的，因为一部分BAM衍生碳除了以CO?形式释放外，还将同化为生物质，并且该比例可以根据条件变化。此外，在具有连续水流的处理系统（如砂滤池）中，生物强化的有效性取决于降解菌快速生长和建立的能力，这由λ和μ捕获，而不是由A捕获。通过从微宇宙中提取细胞并在选择性琼脂培养基上通过滴板10 μL的10倍稀释系列计数菌落形成单位（CFU）来确定t₇时MSH1（D_MSH1）和K169（D_K169）的细胞密度。此外，在蓝色光透照器上检查选择性琼脂培养基R2A + 100 mg/L BAM + 50 mg/L Km上的CFU的GFP荧光以确认菌落为MSH1。

通过将30 g灭菌砂和20 mL MMO培养基加入马弗处理的50 mL玻璃小瓶中进行砂的有机碳解吸，三重复。小瓶在20°C静态孵育7天。每24小时，溶液通过0.45 mm过滤器过滤并用20 mL MMO培养基替换，除了三个小瓶的溶液仅在第七天过滤。如上所述测定所有提取物中的DOC含量。

使用IBM SPSS Statistics 22通过成对Tukey检验确定不同组装和条件下λ、μ、A、D_MSH1和D_K169之间的显著差异（P < 0.05）。

结果

初始MSH1和K169细胞密度的影响

为了评估MSH1或K169是否需要特定的初始细胞密度才能发生协作互动，测试了不同初始K169或MSH1细胞密度与固定MSH1或K169细胞密度组合的效果，导致不同的初始MSH1/K169比率。矿化动力学如图所示。λ、μ、A、D_MSH1和D_K169的值如表所示并以图形方式呈现。计算的双种系统和相关单种系统之间各自参数的倍数变化如表所示。

如先前报道，当MSH1和K169以相等的起始密度10? cells/mL共接种时，K169的存在增强了BAM矿化，表现为更短的λ和更高的μ。在相同的高初始MSH1细胞密度（10⁷ cells/mL）但降低的K169初始细胞密度（从10⁷到10³ cells/mL）下，K169对BAM矿化的积极影响转变为消极影响。对λ的积极影响（尤其在10⁴ cells/mL及以下）逐渐消失，直到达到0.24 h，与MSH1单种系统中观察到的值（0.28 h）无显著差异。类似地，当应用10⁴ cells/mL及以下的K169初始细胞密度时，μ值降低直至4.54%/h，显著低于MSH1单种系统的值（6.92%/h），表明消极影响。A值随着K169细胞密度的降低而降低。尽管对BAM矿化动力学有影响，但双种系统中的D_MSH1未受影响。另一方面，双种系统中的D_K169随着初始K169细胞密度的降低而降低。此外，当接种的K169细胞密度为10⁴ cells/mL及以下时，D_K169达到相似但不高于相应K169单种系统中的值，表明在较低初始K169密度下K169失去了来自MSH1的利益。我们得出结论，降低初始K169细胞密度对MSH1和K169之间的合作有消极影响，尤其对BAM矿化动力学和K169生长产生负面影响，特别是在K169细胞密度为10⁴ cells/mL及以下时。

在恒定的K169初始细胞密度为10⁷ cells/mL下，将初始MSH1细胞密度从10⁷降低到10³ cells/mL明显影响BAM矿化，因为λ增加，尽管μ保持不变。有趣的是，比较具有相同初始细胞密度的MSH1 + K169组装和相应的MSH1单种系统，可以观察到（i）在10⁷ cells/mL时观察到的对λ的积极影响在MSH1细胞密度为10⁵ cells/mL及以下时转变为中性甚至消极影响，而（ii）对μ的积极影响保持不变。此外，A值也从在10⁷ MSH1 cells/mL时低于MSH1单种系统的值变为在10⁵ MSH1 cells/mL及以下时高于MSH1单种系统的值。在较低初始MSH1细胞密度下BAM矿化动力学参数的变化与t₇时较低的MSH1细胞密度一致，如双种系统中D_MSH1值所示。然而，t₇时的低MSH1细胞密度不能是唯一解释；可能改变的K169-MSH1相互作用也起了作用，因为用10⁴ MSH1 cells/mL接种的MSH1 + K169组合中的D_MSH1比用10⁴ MSH1 cells/mL接种的MSH1单种系统低4.6倍，尽管在初始MSH1细胞密度为10³ MSH1 cells/mL的情况下未观察到这一点。K169细胞密度未受影响。我们得出结论，降低双种系统中的初始MSH1细胞密度在MSH1细胞密度为10⁴ cells/mL及以下时对MSH1和K169之间的合作产生消极影响，尤其影响BAM矿化，而K169的生长未受影响。

然后我们在第二个实验中测试了降低两种菌株初始但相同细胞密度（即10⁷–10⁴ cells/mL）的影响。图表如图所示。λ、μ、A、D_MSH1和D_K169的值如表所示。计算的双种系统和相应单种系统之间各自参数的倍数变化如表所示。

尽管MSH1在t₇时显示出相同的细胞密度（3.1–3.8 × 10⁸ CFU/mL），但BAM矿化动力学差异很大，尤其是关于μ。在初始细胞密度为10⁷、10⁶和10⁵ cells/mL时，λ和μ分别保持低于和高于相应MSH1单种系统中的值，并且λ甚至低于初始密度为10⁷ cells/mL的单种系统。A值随着细胞密度的降低而下降。在初始细胞密度为10?、10?和10? cells/mL时，A低于相应MSH1单种系统中的值。然而，在初始细胞密度为10⁴ cells/mL时，未观察到与MSH1单种系统相比K169的有益效果。类似地，D_K169值独立于初始细胞密度，并且在MSH1存在时改善（因子1.9–2.1），除了在初始细胞密度为10⁴ cells/mL时，K169达到较低数量并且似乎受到MSH1的消极影响（因子2.7）。这些结果表明，K169对MSH1的有益影响，反之亦然，以及因此的合作，也发生在两种菌株接种细胞密度低至10⁵ cells/mL时。然而，在较低细胞密度下，合作恶化。

乙酸盐浓度的影响

测试了不同浓度的乙酸钠（即0、50、100和150 μg/L）以检查对MSH1–K169相互作用的影响。两种菌株均以10⁷ cells/mL接种。λ、μ、A、D_MSH1和D_K169的值如表所示。计算的双种系统和相应单种系统之间各自参数的倍数变化如表所示。

降低乙酸盐浓度导致λ和μ增加，以标准情况（150 μg/L乙酸钠）为参考。然而，对于大多数乙酸盐浓度，与添加相同乙酸盐浓度的MSH1单种系统相比，双种系统中的λ和μ值分别保持较低和较高。例外是当不添加乙酸盐时，与MSH1单种系统相比，双种系统中的λ仍然较低，但μ变得相等。然而，双种和单种情况之间λ的倍数变化随着乙酸盐浓度的降低而增加，表明K169对BAM矿化的影响随着乙酸盐浓度的降低而减弱。双种系统中的A值低于单培养，除非乙酸盐浓度为100 μg/L。MSH1的细胞密度（D_MSH1）未受影响，显示在单种和双种系统中相等的细胞密度，与添加的乙酸盐无关。MSH1对K169生长和最终细胞密度（D_K169）的有益影响似乎与乙酸盐浓度无关，即使不补充乙酸盐，K169的密度在MSH1存在下也比没有MSH1时高83倍。我们得出结论，乙酸盐在K169对MSH1功能性的积极影响中仅起中等作用，而对于MSH1对K169生长的积极影响并非必需。

砂有机碳的影响

由于乙酸盐在MSH1和K169之间的相互作用中起次要作用，另一个碳源必须喂养合作。砂，尽管经过洗涤和灭菌，可能含有可同化的有机碳。因此，检查了砂上存在的有机碳的作用。本实验中不添加乙酸盐，并且两种菌株始终以10⁷ cells/mL接种。矿化曲线如图所示。λ、μ、A、D_MSH1和D_K169的值如表所示。计算的双种系统和相应单种系统之间各自参数的倍数变化如表所示。

砂上的有机碳对合作至关重要，因为在含有缺乏有机材料的砂（通过马弗处理砂实现）或没有砂的微宇宙中，协作互动从两个伙伴的站点消失。具体来说，λ和μ值变得与单种系统中的值相等；与MSH1单种系统中的D_MSH1相比，D_MSH1在K169存在下较低（在马弗处理砂中低8.3倍，在不添加砂的情况下低17倍）；并且D_K169变得相等。此外，当将从砂中提取的DOC添加到马弗处理砂中时，有益效果恢复，因为与MSH1单种系统相比，双种系统中的λ降低（分别1.48和1.82倍），而μ相等。然而，MSH1和K169的密度在双种系统中分别比单种系统中低2.4和4.3倍。当将从砂中提取的DOC添加到没有砂的微宇宙中时，强调了DOC的作用，因为在这些条件下，与MSH1单种系统相比，λ较低而μ较高，指出K169对BAM矿化的有益影响。然而，在含有添加DOC但没有砂的微宇宙中，与单种系统相比，双种系统中的D_MSH1和D_K169较低（分别2.3和4.1倍）。此外，与不添加DOC的条件相比，含有添加DOC的微宇宙中双种系统中的D_K169较低（在马弗处理砂中因子2.7，在无砂系统中因子4.8）。对于在含有添加DOC提取物的系统中MSH1和K169细胞密度降低的一个合理解释可能与DOC提取物的总有机碳含量低于原始砂滤微宇宙中的含量有关，因为由于砂吸收的有机碳和溶解在水中的有机碳之间的平衡，可能仅提取了一部分DOC。因此，我们使用原始砂进行了DOC解吸实验，并检查在第一个平衡步骤后是否可以从砂中提取额外的有机碳。情况确实如此。累积解吸达到56.0 mg有机C/L，而仅从一个提取步骤获得的DOC溶液含有35.0 mg有机C/L。我们得出结论，砂上的有机碳对于MSH1和K169之间的合作至关重要。

讨论

初始MSH1/K169细胞比率的差异影响K169和MSH1之间的协作互动

先前，当MSH1和K169均以初始细胞密度10⁷ cells/mL接种时，观察到A. niigataensis MSH1和Piscinibacter sp. K169之间的协作互动。MSH1通过促进其生长对K169的细胞密度产生有益影响，反之，K169对BAM矿化产生积极影响，尽管不影响MSH1细胞密度。如先前观察到的，我们注意到，尽管实验设置高度标准化，但在本研究以及早期研究的实验中，单培养和双培养系统中的BAM矿化动力学参数、D_MSH1和D_K169都在实验之间变化。这种变异性背后的机制目前尚不清楚。然而，当MSH1和K169均以初始细胞密度10⁷ cells/mL接种时，同一实验中两种菌株之间的积极互动和明显合作始终显著且明显。这种合作的机制目前未知，但可能遵循其他细菌协作互动，解释为（i）去除阻碍伙伴功能的废物产品，（ii）交换生长底物或化合物如辅因子和维生素，以及（iii）种间化学信号。

改变初始接种密度影响群落结构以及两个伙伴之间的相互作用，导致受影响的BAM矿化功能，但仅当其中一个伙伴（MSH1、K169或两者）的初始细胞密度相对较低时。它支持Gao等人的研究，该研究得出结论，群落组装和相互作用不是两个物种的固有特性，而是可以响应所涉及物种的初始相对丰度进行调节的涌现特性。类似地，Aharonovich和Sher以及Venturelli等人报道初始比率改变了种间相互作用的性质，而Katsuyama等人预测农药降解种间联盟两个成员的动态和共存取决于相对的初始种群大小以及控制合作的互惠活动。如Gao等人观察到的，相互作用的改变大多在两个成员之一初始密度相对较低时观察到。低K169或低MSH1细胞数可能导致未能建立两种生物之间合作所需的代谢耦合途径，例如，废物产品周转不足或促进MSH1功能和K169生长的化合物生产不良。有趣的是，在低初始K169/MSH1比率的情况下，MSH1功能受影响而不是D_MSH1，支持K169主要支持MSH1活性的假设。另一个有趣的特征是，在高初始MSH1/K169比率和高初始K169/MSH1比率的情况下，D_K169和D_MSH1低于其相应单培养系统中观察到的最终密度。这可以通过两种生物之间对生长资源的竞争来解释。如本研究所显示，砂上的有机碳代表伙伴关系的主要碳源。虽然砂上有机碳的确切组成目前未知，但它可能由不同的化合物组成，其中一部分可能在伙伴之间共享。可能，当两种生物之一初始以比另一种高得多的细胞密度存在时，前者可能获得可用共享砂碳源的更好份额。然而，当两种生物均以低初始细胞密度10⁴/mL存在时，既不预期代谢耦合的不良建立，也不预期对资源的竞争，而在这些条件下，伙伴关系受到消极影响。因此，我们提出，有效的合作的理想空间模式可能在较低细胞密度下受到影响，如先前观察到的公共物品生产者和作弊者之间的相互作用（即当MSH1细胞和K169以相当低的细胞密度接种时，两个伙伴生长但彼此分离，因此相互作用有限）。砂颗粒作为定殖基质