基于洗涤剂（Tween）的海洋颗粒物微生物温和解离策略优化及其群落响应机制研究

本研究系统评估了非离子型洗涤剂Tween 20与Tween 80对海洋颗粒附着微生物（PA）的解离效果，通过流式细胞术（flow cytometry）和16S rRNA基因扩增子测序证实，Tween 80在185 RPM振荡10分钟条件下能高效释放颗粒微生物并维持细胞完整性，显著富集优势PA类群（如Verrucomicrobiaceae、Flavobacteriaceae），为单细胞微生物学（如细胞分选、稀释培养）提供了关键前处理技术支撑。

　　

ABSTRACT

海洋颗粒通常由有机碎屑和细胞残骸组成，其携带的微生物群落与浮游海洋中的自由生活（FL）群落存在显著差异。然而，若未先将微生物从颗粒和微生物聚集体中分离，这些微生物无法通过流式细胞术、细胞分选和基于稀释的分离等单细胞微生物学方法进行深入研究。为解决这一难题，本研究比较了两种常用洗涤剂Tween 20和Tween 80对颗粒附着海洋微生物群落的解离效果。通过流式细胞术量化了Tween处理在不同季节和地点多个群落中释放颗粒细胞及维持细胞完整性的能力。在185 RPM振荡条件下，Tween 20和Tween 80均能温和地将微生物从颗粒上解离，且细胞死亡率极低。此外，Tween 80将更多颗粒附着细胞释放到自由生活组分中。通过对其中一次采集样本的颗粒附着和自由生活组分进行16S rRNA基因扩增子测序，分析了Tween处理对微生物群落组成的影响（与未处理对照相比）。Tween 20和Tween 80均能有效实现微生物从颗粒上的解离；然而，Tween 80处理在解离群落中表现出更高的一致性，并显著富集了最丰富的颗粒附着成员。这些数据表明，Tween 80在温和解离颗粒附着细胞方面最为有效。

IMPORTANCE

栖息于海洋颗粒有机质上的微生物是海洋生物地球化学的关键组成部分。它们在降解所依附的颗粒时，形成的活动集中区域影响周围的生物地球化学和氧化还原梯度，使得颗粒附着微生物对整体海洋生态学具有重要意义。为理解颗粒上微生物聚集中的单细胞活动，必须首先将细胞从基质上移除以供下游分析。虽已有从固体表面或沉积物群落中解离微生物的方法报道，但针对更易消散的颗粒且能维持细胞活力和保存DNA用于下一代测序的类似方法研究尚不充分。本研究优化了一种利用洗涤剂从海洋颗粒中解离微生物的方法，通过滤膜尺寸分级、流式细胞术和群落组成分析评估其有效性，并为温和有效地从海洋颗粒中移除微生物提供了建议。

INTRODUCTION

海洋颗粒来源于广泛的生物和非生物源，主要由细胞碎屑、粪便颗粒和有机碎屑的聚集体组成。这些颗粒被广泛定义为颗粒有机质（POM），由于其营养物和碳的浓缩，代表了微生物活动的热点区域，微生物暂时或永久地栖息于此。颗粒附着（PA）微生物形成复杂群落，协同努力降解POM，且PA微生物组合通常反映了颗粒内存在的代谢生态位阵列。PA群落在分类学上与浮游/自由生活（FL）群落不同，并受不同环境条件的影响，基因组证据表明这两类群落之间存在显著不同的生理学特性。因此，PA群落占据了与FL群落不同的生态位。然而，PA群落通常无法通过单细胞微生物学方法（包括流式细胞术和荧光激活细胞分选、稀释至灭绝培养方法以及单细胞基因组学）进行研究，而这些方法极大地促进了对许多重要微生物谱系和生态过程生态生理学的理解。例如，PA微生物以密集聚集体形式生活在颗粒内部或表面，因此流式细胞仪无法区分单个细胞，且颗粒可能堵塞仪器的流体管路。其他单细胞方法面临类似挑战。因此，将PA微生物从其颗粒上解离，使其可用于更广泛的方法以研究其生态生理学。

许多方法已被开发用于从表面分离微生物。一种解离颗粒附着和沉积物附着微生物的有效方法涉及10%（体积/体积）甲醇和超声处理。尽管甲醇 disruption 方法已应用于海洋颗粒、瘤胃 digesta 固体和深海沉积物，但10%（体积/体积）甲醇需要向样品中添加大量化学品，且对微生物细胞有毒，从而抑制了解离细胞的生长和繁殖。其他使用低pH、甲醛、叔丁醇和甲基纤维素的方法对微生物细胞具有类似的毒性作用，且有些还阻止下游DNA测序。密度离心是另一种已成功解离沉积物附着细胞的方法；然而，该方案耗时较长，试剂昂贵，且多次离心和上清液去除步骤可能导致细胞损失。

洗涤剂是解离沉积物、土壤、食品工业表面和大气颗粒中微生物的流行选择，因为它们破坏了微生物和颗粒之间的连接。常用的洗涤剂包括焦磷酸酯和Tween，分别代表离子型和非离子型洗涤剂。离子型洗涤剂含有带电荷的极性头基，产生强烈的去稳定效应，使其成为细胞裂解缓冲液的理想组分。然而，如果目标是维持细胞膜完整性和活力，离子型洗涤剂由于其与蛋白质和脂质膜的高亲和力而非最佳选择。非离子型洗涤剂具有不带电荷的极性头基，是破坏微生物和颗粒之间连接的更温和选择。此外，周围基质的离子强度对非离子型洗涤剂的功效影响很小或没有影响，使其成为海洋应用的合适选择。

Tween系列非离子型洗涤剂常用于稳定酶和分离蛋白质，且稀释浓度先前已用于从沉积物和大气颗粒中解离微生物以供下游流式细胞术应用。Tween 20和Tween 80是常用的Tween洗涤剂；然而，它们从海洋颗粒中移除微生物的功效尚未得到证实。先前证明对沉积物或大气微生物群落有效的相同浓度和变化的这些洗涤剂，可能对海洋PA群落产生不同的效果，原因是海洋颗粒的脆弱和短暂性质、其上发生的独特且动态的群落、过程和相互作用，以及微生物用于附着的多种机制。

我们测试了Tween 20和Tween 80从海洋颗粒中释放细胞的功效。我们使用流式细胞术量化了Tween处理在不同季节和地点样本中的有效性，以枚举从PA组分解离到FL组分的活细胞数量，并通过Tween处理后相对于未修改对照的PA和FL微生物群落组成的16S rRNA基因扩增子分析，确定了哪些生物受到处理的影响。Tween 80处理 consistently 富集了最丰富的颗粒附着类群，而Tween 20处理更可变且富集了较稀有的颗粒附着类群， corroborating 流式细胞术观察结果，即低浓度的Tween 80是从海洋颗粒中解离PA微生物最有效的。

RESULTS AND DISCUSSION

Experimental design

我们基于常见的顺序过滤程序制定了一个实验计划，以分离颗粒附着与自由生活海洋微生物。我们选择2.7 μm作为定义PA群落的截止值，0.22 μm以捕获大多数剩余细胞。我们的实验逻辑是，有效的解离处理将颗粒上的细胞释放，会导致比没有此类处理时更大比例和多样性的微生物通过2.7 μm过滤器。我们的处理包括常用洗涤剂Tween 20和Tween 80，我们在先前用于从沉积物中释放细胞的范围内测试了四种浓度（0.001%、0.005%、0.01%和0.1% [体积/体积]），以及未接受Tween的对照。然后，我们使用流式细胞术测量多种处理类型和样本中总体细胞数量和活细胞的变化，因为它是高通量的，需要低样本体积，并且比直接显微镜计数提供更高的准确性。此外，我们预计我们的处理会完全降解一些颗粒，如常见的短暂凝胶状基质，因此使颗粒上细胞数量变化的显微镜评估不可靠。我们选择使用碘化丙啶作为细胞活力的代表，因为它可用于流式细胞术的高通量 context，并避免了与菌落形成单位等活力测量相关的培养偏差。此外，我们通过16S rRNA基因扩增子测序进行了群落组成分析，以比较Tween处理后通过2.7 μm过滤器的微生物细胞的差异，并识别哪些类群从颗粒中释放。

Cellular dissociation and viability

我们通过流式细胞术评估了Tween处理在两个不同采样点的解离效率：圣莫尼卡湾，代表海岸系统；和圣佩德罗海洋时间序列站（SPOT），代表开阔海洋系统。我们量化了在185 RPM下振荡5或10分钟后相对于无Tween振荡对照和无处理对照的总FL细胞和膜受损FL细胞。在我们2023年秋季的圣莫尼卡湾实验中，我们观察到在Tween 80 0.005%、0.01%和0.1%中振荡10分钟释放的细胞最多，细胞密度相对于对照的中位数百分比增加分别为69.3%、75.6%和70.7%。所有Tween/振荡处理的细胞死亡率相似，低于总细胞计数的2%。对照显示约1%的细胞死亡率。我们2024年春季的SPOT实验具有不同的绝对数字，但趋势 corroborated 我们之前的实验。在振荡5分钟时，Tween 20和Tween 80的结果更相似，但在振荡10分钟时，基于相对于对照的细胞增加百分比，Tween 80产生略高的细胞解离，尽管几乎所有Tween处理都导致FL细胞密度显著增加（P值≤0.05）。我们在Tween 80 0.001%、0.005%和0.01%中振荡10分钟观察到最高解离，细胞密度相对于对照的中位数百分比增加分别为52.7%、50.3%和54.6%。Tween 20和Tween 80之间的细胞死亡率相似，且代表少于总细胞计数的4.5%，而对照中的死亡率约为2%–3%。在SPOT样本中观察到的较高死亡率可能与样本收集和处理时间的差异有关；然而，两个实验都表明，在0.005%–0.01%的Tween 80中振荡10分钟将最多的PA细胞解离到FL组分中。

对扰动类型和持续时间的变更确认了Tween 80和10分钟185 RPM振荡是最一致的处理。使用跨多个季节的圣莫尼卡湾地表水的实验表明，与185 RPM振荡相比，涡旋引入了解离频率的更多可变性，并且在某些情况下， drastically 增加了细胞死亡率。使用夏季地表样本直接比较10分钟振荡与涡旋显示可比结果。然而，当使用秋季样本比较5分钟与10分钟涡旋时，我们发现10分钟处理中的细胞死亡率非常高，在15%至17%之间，远超过未处理对照的2%–3%。比较夏季与秋季10分钟涡旋后的细胞死亡率表明，涡旋根据季节间推测的微生物群落组成差异 differentially 影响细胞死亡率。185 RPM振荡提供与涡旋相当或更高的细胞解离，并且在夏季和秋季季节间细胞死亡率的结果更一致。总的来说，我们的实验表明，Tween 80与温和振荡10分钟可可靠地解离来自各种不同样本类型的PA细胞，且通常数量高于Tween 20。

Community effects

为评估解离处理对微生物群落的影响并识别哪些类群从颗粒中释放，我们使用了地表水的全群落16S rRNA基因扩增子测序，这些群落经过上述相同的Tween条件套件和 carboy 的手动温和振荡（大致相当于185 RPM振荡）处理。如预期，基于许多先前的观察，PA和FL群落在主坐标分析（PCoA）中是 distinct 的，PCo1分离了PA和FL群落，并解释了78.18%的方差（R2=0.96）。PCo2似乎与Tween处理相关，仅解释了4.46%的方差（R2=0.98）。在PA和FL群落中，处理后群落结构从紧密聚集的对照群落 diverged away。我们还观察到处理后FL群落沿PCo1的轻微移动，表明一些释放的PA类群影响了FL群落的组成。PA群落的重复样本高度 divergent，并未基于Tween处理形成一致的簇，表明解离结果存在高度异质性。为量化处理间异质性程度，我们检查了每个处理重复中共享或独特的操作分类单元（OTU）的百分比。平均43%的OTU在PA和FL群落中都是单个重复独有的，表明跨过滤器和处理收集的微生物群落存在相当大的 variation，并 corroborating 了处理间PCo2中观察到的方差。我们在对照PA和对照FL处理的所有三个重复中检测到平均37%的OTU。因此，我们 separately 将PA-OTU和FL-OTU定义为那些分别在对照2.7和0.22 μm过滤器的所有三个重复中检测到的OTU，然后跟踪这些“核心”OTU的变化，以获得对其相对丰度如何响应Tween处理的变化的有意义理解。

OTU specificity

成功的微生物从颗粒解离将使这些PA-OTU在FL组分（0.22–2.7 μm）中富集。我们计算了Tween处理后FL组分中PA-OTU相对丰度的 fold change，并识别了316个PA-OTU，这些OTU在至少一个Tween处理中增加超过一倍。使用这些316个PA-OTU的主坐标分析，我们发现从Tween 80和Tween 20处理中释放的群落是不同的，Tween 20 0.1%处理与所有其他处理 diverged。从Tween 80处理中释放的OTU在群落组成上表现出比从Tween 20处理中释放的OTU更少的 variation，暗示Tween 80的解离效应更一致。前两个主坐标PCo1和PCo2共同仅解释了群落组成中40.2%的方差，这表明Tween处理间PA-OTU组成的差异是复杂的，且关系不易简化为主坐标。然而，这些结果表明，Tween处理的选择不仅影响细胞解离的 magnitude，还影响富集微生物群落的一致性。

我们观察到不同的PA-OTU驱动了Tween 20和Tween 80群落之间的分离，并且这些差异与分类学无关。例如，与Tween 80处理高度相关的PA-OTU包括来自 Proteobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Actinobacteria 和 Planctomycetes 门的成员，但我们在驱动Tween 20处理间变异的PA-OTU中也观察到这种广泛分类学代表性。 instead of 分类学效应，我们观察到OTU丰度与Tween 20或Tween 80的富集差异相关。OTU丰度对应于OTU编号（00001为最丰富），并且许多最丰富的PA-OTU在主坐标分析中与Tween 80处理对应，而与Tween 20处理相关的PA-OTU是较不丰富或稀有的类群，除了两个与Tween 20 0.1%处理相关的OTU。当使用0.1%相对丰度截止值将OTU定义为“丰富”时，在达到或超过该截止值的65个PA-OTU中，21个与Tween 80处理相关，仅三个与Tween 20处理相关。此外，我们将富集的PA-OTU（E-PA-OTU）定义为那些在至少一个Tween处理中相对于FL对照显著增加的OTU（n=85，P值≤0.05）。在主坐标分析中与Tween 80处理相关的大多数PA-OTU由E-PA-OTU组成，而与Tween 20处理对应的E-PA-OTU相对较少。总之，这些结果表明Tween 80处理富集了最能代表PA微生物组分的类群。

Abundant vs rare PA-OTU enrichment

更多丰富的E-PA-OTU与Tween 80处理相关而不是Tween 20这一事实并不意味着这些OTU从未被Tween 20富集。 rather，Tween 80处理比Tween 20更富集这些OTU，类似于Tween 80总体上释放更多活细胞。例如，最丰富的E-PA-OTU之一，Otu00009（Verrucomicrobiaceae的成员，一个常见检测的PA组），在所有Tween处理中都被富集，但相对丰度的最大变化是在Tween 80处理中，特别是Tween 80 0.005%，其丰度 more than doubled。其他丰富的E-PA-OTU，Otu00019和Otu00028，分别是Verrucomicrobiaceae和Flavobacteriaceae中Tenacibaculum的成员（也是典型的PA群落组），在Tween 20处理中略微富集，但在Tween 80处理中富集得多。 upon visual 和 statistical inspection，这些类群中的大多数在Tween 80处理中比在Tween 20处理中更高度富集，特别是数值OTU标识符小于Otu00050的类群， thus corroborating PCoA结果。此外，所有这些丰富的E-PA-OTU都与先前在PA群落中识别的类群匹配， confirming 我们检测到的分类学富集趋势。

尽管大多数丰富的E-PA-OTU在Tween 80处理中变得富集，但有一些 instead 与Tween 20处理相关并被其更好地富集。其中两个—Otu00024和Otu00034，分别是Flavobacteriales和Proteobacteria的未分类成员—与Tween 20处理 strongly correlated， primarily driven by 高度 divergent 的Tween 20 0.1%处理。Tween 20在0.1%时导致Otu00024和Otu0034的平均 fold change 增加分别为11和27，几乎是这些OTU在所有其他处理中 fold change 增加的两倍。Otu00136和Otu00169，Gammaproteobacteria中Pseudomonadaceae和Psychromonas的成员，也与Tween 20处理相关，但 predominantly driven by Tween 20 0.001%、0.005%和0.01%处理。Otu00136在Tween 20 0.001%和0.01%中 most highly enriched，在每个处理中分别增加约六倍和九倍。而Otu00169在Tween 20 0.005%中增加约三倍。这些OTU在Tween 20处理中的富集可能表明它们附着颗粒的方式，或这些生物居住的颗粒基质，对Tween 20溶解 particularly responsive。

稀有E-PA-OTU包括数值OTU标识符大于Otu00184的OTU，并且 upon visual 和 statistical inspection，这些类群中的大多数在Tween 20中比在Tween 80处理中更高度富集。Otu00192，Cryomorphaceae的成员（Flavobacteriia中常见检测的谱系），在Tween 80 0.01%和其他Tween 20处理中富集，但 most highly enriched by Tween 20 0.005%。Otu00210、00216、00306和00456被至少两个Tween 20处理富集，几乎没有任何Tween 80处理富集。这些OTU包括Verrucomicrobiaceae和Bacteroidetes的未分类成员，两者都在其他PA微生物群落中 consistently detected。Otu00419，Synechococcus的代表，与Tween 20处理相关，并 specifically 在Tween 20 0.001%和0.005%中富集。尽管Otu00419也被Tween 80 0.005%富集，但效果在Tween 20 0.005%处理中更大，表明Otu00419与Tween 20处理的相关性基于细微差异。Synechococcus蓝藻通常在PA组分中检测到，并在沿海水域形成聚集体， thus making them representative of the particulate organic matter pool。

总的来说，我们观察到的PA群落以细菌为主；古菌OTU（nOTU=48）仅占总数的0.048%±0.002%；然而，两个古菌OTU，Otu00739和Otu00934，仍然 among the E-PA-OTUs。Tween 20处理通常在解离古菌OTU方面表现不佳， aside from Tween 20 0.001%，它富集了Otu00739。在Tween 80处理中，Tween 80 0.005%在富集古菌OTU方面表现最佳， nearly tripling Otu00739的相对丰度，并 nearly doubling Otu00934的相对丰度。Otu00934和Otu00739通过blastn比对分别属于 Marine Group II（99.6% identical）和 Marine Group III（99.6% identical）。 Marine Group II和 Marine Group III都在PA组分中检测到， further corroborating 我们正在测量的PA-OTU的显著增加。

我们不知道Tween 80在富集最丰富的PA-OTU方面优于Tween 20的机制，但我们推测它源于Tween 20和Tween 80侧链的差异。Tween 20和Tween 80都被表征为聚山梨酯非离子型洗涤剂，并且它们的脂肪酸侧链不同：Tween 20具有饱和的12碳（12:0）月桂酸侧链，而Tween 80具有不饱和的18碳（18:1）油酸侧链。通常，脂肪酸中较长的烷基链更疏水。尽管烷基链中的双键降低了疏水性，但油酸的疏水性值几乎是月桂酸的两倍。因此，Tween 80的较高疏水性可能更好地破坏微生物粘附策略，如柄或菌毛，这些策略 typically 是疏水性的。

Non-specific E-PA-OTUs

一些E-PA-OTU与任何特定Tween处理无关，而是在所有处理中都增加。例如，Otu00333，Verrucomicrobiaceae的未分类成员，一个常见检测的PA组，在所有处理中相对丰度 approximately tripled。类似地，Otu00125（未分类Flavobacteriaceae）、Otu00128（Crocinitiomix）和Otu00326（Cryomorphaceae），所有Bacteroidetes的成员，先前在PA群落中检测到，也在所有处理中高度富集。Otu00079，Proteobacteria的未分类成员，和Otu00152，Alphaproteobacteria中Phaeobacter的代表（另一个先前在PA组分中检测到的组），也在所有Tween处理中均匀富集。Otu00545，Flavobacteriales的未分类成员，在所有处理中高度富集，平均约两到七倍相对丰度增加，除了在Tween 80 0.001%中，它增加约17倍。尽管在Tween 80 0.001%中如此高度富集，Otu00545并未包括在显著驱动Tween处理间PA-OTU差异的OTU中， likely due to overlapping fold changes in relative abundance between Tween 20 and the other Tween 80 treatments。

Eukaryotic algal enrichment

E-PA-OTU中叶绿体的存在可能是细胞裂解的证据，因为大多数真核浮游植物不会通过2.7 μm孔径过滤器。我们识别出未分类叶绿体OTU Otu00044、Otu00055、Otu00249和Otu00304分别属于Heterosigma akashiwo（99.2% identical）、Fibrocapsa japonica（100% identical）、Aureococcus anophagefferens（99.6% identical）和未知海洋真核生物（99.21% identical）。前三个是真核藻类，细胞大小通常范围从3到60 μm。我们还观察到硅藻叶绿体OTU，Otu00015和Otu00514，分别对应于Skeletonema pseudocostatum（98.8% identical）和Bolidophyceae spp.（99.6% identical）。Skeletonema pseudocostatum是一种链形成硅藻，单个细胞大小范围从2到9 μm，而Bolidophyceae是Stramenopiles中的藻类，与硅藻 sister，细胞大小范围从4到6 μm。这些大细胞大小支持了我们的假设，即Tween处理导致真核细胞裂解和/或链 disruption。人们可能假设较高浓度的洗涤剂会导致更多细胞裂解，但我们观察到在最高和最低Tween浓度间真核叶绿体富集的重叠。此外，我们的流式细胞术观察并未表明一种处理比另一种导致增加的细胞死亡率，即使我们的流式细胞仪样本核心直径为16 μm，使我们能够用活/死染色检测受损的较大细胞。这表明Tween处理确实 disrupt 真核细胞，但相互作用难以用现有数据预测。

Conclusion

总之，流式细胞术和群落组成分析表明，Tween 20和Tween 80都有效解离颗粒上的微生物，但具有不同的结果。Tween 80处理通常解离更高 magnitude 的PA细胞，细胞密度增加高达70%。而且，Tween 20和Tween 80处理间的细胞死亡率 consistently similar，表明Tween 80同样温和，但比Tween 20更有效。此外，与涡旋相比，185 RPM振荡是更可靠的扰动方法，特别是对于持续时间超过5分钟的情况。在OTU水平上，Tween 80在解离群落中表现出比Tween 20更大的一致性，并显著富集了最丰富的PA-OTU， thus capturing 最能代表PA群落的成员。Tween 80处理在将古菌PA细胞解离到FL组分中也更有效，特别是Tween 80 0.005%。我们建议分别采样FL和PA群落，因为Tween处理确实影响FL群落的群落组成。Tween 80还可靠且有效地将广泛范围的PA细胞解离到FL组分中，跨海洋环境。为限制添加到宝贵样品中的洗涤剂量，并以有限的细胞死亡率捕获PA微生物的广泛分类学代表性，我们推荐Tween 80 0.005%，因为它在温和解离和不损害解离能力之间取得了平衡。

MATERIALS AND METHODS

Environmental sample collection

对于16S rRNA基因群落组成分析，我们于2021年11月20日从圣莫尼卡湾手动采集了60 L地表水，装入四个20 L无菌聚碳酸酯 carboy，每个 carboy 有5 L顶空。样本收集后1小时内开始处理。对于流式细胞术分析，后续采样于2023年2月16日（冬季）、4月3日（春季）、6月29日（夏季）和11月26日（秋季）从同一圣莫尼卡湾站点进行，将3 L地表水收集到无菌4 L carboy 中，样本收集后1小时内开始处理。对于额外流式细胞术分析，样本于2024年5月15日从圣佩德罗海洋时间序列采样站点收集，以反映更 characteristic 开阔水域的微生物群落，具有 offshore 地球化学。由于样本收集的后勤原因，carboy 存储在接近环境海水温度（20°C），样本处理在样本收集后18小时内进行。

Microbial dissociation from particles

我们测试了四种浓度的Tween 20和Tween 80。我们将5% Tween 20和Tween 80（体积/体积）储备溶液在无菌磷酸盐缓冲盐水（1×）中稀释到地表水（样本体积 below）中，终浓度为0.001%、0.005%、0.01%和0.1%（体积/体积），以及未处理对照。我们通过尺寸分级分离颗粒附着和自由生活类群，其中捕获在2.7 μm孔径GF/D过滤器上的细胞被认为是颗粒附着，而流过2.7 μm过滤器的细胞被认为是浮游/自由生活。实验设计的逻辑是，先前收集在2.7 μm过滤器上的PA细胞在洗涤剂处理和从颗粒解离后将通过这些过滤器。因此，解离后，以前的PA细胞将通过流式细胞术或在更小过滤器孔径（0.22 μm）上收集它们来在2.7 μm滤液中检测。洗涤剂的相对成功将通过总细胞的相对增加（通过碘化丙啶与SYBR Green染色评估）和/或2.7 μm滤液中PA群落成员的相对增加来量化。

对于流式细胞术分析，我们将Tween 20和T