呼吸道合胞病毒磷酸蛋白（RSV P）具有NTP酶和解旋酶样活性：病毒复制新机制与治疗靶点发现

本研究首次揭示呼吸道合胞病毒（RSV）磷酸蛋白（P）具有非经典模式的NTP酶（NTPase）和5′-3′方向RNA解旋酶样活性，通过突变实验证明其酶活性与病毒存活率正相关，为开发靶向P蛋白的抗病毒疗法提供了全新策略。

　　

ABSTRACT

呼吸道合胞病毒（RSV）作为肺炎病毒科（Pneumoviridae）中不分节段的负链RNA病毒（NNSV），是全球婴幼儿和免疫缺陷人群下呼吸道感染的主要病原体。尽管RNA解旋酶在病毒复制中通过RNA重构功能发挥关键作用，但RSV是否具有此类酶活性尚不明确。本研究首次发现RSV磷酸蛋白（P）虽缺乏经典解旋酶 motifs，却表现出核苷三磷酸酶（NTPase）活性和依赖NTP的5′-3′方向RNA螺旋解链能力。突变实验证明NTP水解与解旋酶样活性功能耦合，反向遗传学、RSV微型基因组及抗病毒效应实验进一步表明该活性对病毒存活和复制不可或缺。这些发现确立了P蛋白作为RSV复制关键酶学元件的地位，为肺炎病毒复制机制提供了新见解。

IMPORTANCE

RNA解旋酶及解旋酶样病毒蛋白是病毒RNA复制的核心元件，也是抗病毒药物开发的重要靶点。RSV感染每年导致全球5岁以下儿童约3000万例急性下呼吸道感染、360万住院病例及10万死亡病例，对老年人和免疫缺陷患者也构成严重威胁。本研究首次证实RSV P蛋白具有NTP水解和NTP依赖的RNA解旋能力，突变体病毒实验表明这些酶活性对RSV存活至关重要。该发现不仅重新定义了P蛋白的多功能属性，也拓展了对RSV复制机制的理解，为靶向P蛋白的抗病毒治疗开辟了新途径。

INTRODUCTION

RSV是正肺病毒属（Orthopneumovirus）的代表性病原体，其基因组约15.2 kb，通过10个基因编码11种蛋白。其中核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）和大聚合酶蛋白（L）构成病毒复制必需的最小复合体。N蛋白包裹病毒RNA形成核糖核蛋白（RNP）复合物，P蛋白作为L聚合酶的辅助因子，将其锚定在N-RNA模板上并阻止N蛋白与宿主RNA的非特异性结合。

RNA解旋酶广泛存在于RNA病毒中，通过水解NTP（如ATP、GTP）解链RNA双螺旋、消除二级结构并在复制过程中分离基因组链。目前已在多种病毒中发现具有解旋酶活性的蛋白，如小RNA病毒2C、诺如病毒NS3、黄病毒NS3、冠状病毒Nsp13等。尽管RSV编码蛋白缺乏经典解旋酶 motifs，但埃博拉病毒VP35（与P蛋白功能类似）已被报道具有非经典解旋酶活性，提示RSV P可能具有类似功能。

RESULTS

RSV P具有NTP酶活性

为探究RSV P是否具有解旋酶样活性，研究首先通过昆虫杆状病毒系统表达纯化MBP标签融合的P蛋白（MBP-P），采用比色法检测其NTP水解能力。结果显示P蛋白可有效水解ATP、GTP和UTP，其中对GTP偏好性最强。酶活性依赖二价金属离子，在0.7 mM Mg²⁺浓度时达到峰值，Zn²⁺和Mn²⁺也可支持活性，但较高浓度Mg²⁺会抑制反应。

RSV P具备双链RNA结合与螺旋解链活性

通过凝胶迁移实验发现MBP-P能以剂量依赖方式结合地高辛（DIG）标记的dsRNA，而MBP对照组无此活性。在标准解链实验中，MBP-P可在ATP和Mg²⁺存在下高效解离带有5′和3′悬末端的RNA螺旋底物，其效率与阳性对照MBP-VP35相当。该活性受NTP类型影响：ATP和GTP促进解链，UTP和CTP效果较弱，且Mg²⁺浓度在0.7 mM时活性最优。

RSV P解旋方向性与底物特异性分析

通过设计不同末端结构的RNA底物（3′悬垂、5′悬垂及平末端），发现MBP-P可解链带悬末端的结构，但对平末端无效。其中5′悬末端底物的解链效率显著高于3′悬末端，且ATP浓度增加仅促进5′方向解链，表明P蛋白具有5′-3′方向解旋偏好性。此外，P蛋白仅能解链含RNA悬末端的核酸杂交链（如RNA-DNA杂交体中的RNA链），而对DNA悬末端无活性。

NTP酶活性为解旋功能所必需

通过构建P蛋白缺失突变体（△21–30、△31–60等）及点突变体（KGK/AAA），发现△21–30缺失体与KGK/AAA突变体（第25–27位赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸突变为丙氨酸）完全丧失ATP酶活性。尽管突变体仍保留dsRNA结合能力，但其RNA解旋活性彻底消失，证明NTP水解与解旋功能耦合。

解旋酶活性对RSV存活与复制至关重要

将KGK/AAA突变引入RSV A2株感染性克隆后，病毒无法在细胞中产生感染性颗粒，免疫荧光检测未见糖蛋白（GP）表达。Western blot证实突变不影响P蛋白表达及其与N蛋白互作，但微型基因组实验显示病毒RNA复制效率显著降低，感染性病毒产量急剧下降，表明P蛋白的解旋酶样活性是RSV复制的关键因素。

DISCUSSION

本研究首次报道RSV P蛋白具有非经典模式的RNA解旋酶样活性，其功能依赖于NTP水解和二价金属离子，方向性为5′-3′。该发现将RSV P纳入病毒编码的RNA重构蛋白家族，拓展了对病毒复制机制的认知。

在RSV复制周期中，P蛋白作为聚合酶辅因子与L、N蛋白形成复制复合体，可能通过解旋dsRNA复制中间体促进RNA转录、翻译和衣壳化。此外，P蛋白的解旋活性可能通过破坏病毒dsRNA结构，逃避RIG-I等天然免疫传感器的识别，从而双向调控病毒复制与免疫逃逸。

尽管P蛋白缺乏经典解旋酶 motifs，其功能却与SF3家族解旋酶类似，表明蛋白质高级结构而非线性序列可能决定其酶学功能。该发现为针对P蛋白NTPase/解旋酶活性的抗病毒药物设计提供了新靶点，对相关病毒RNA代谢机制研究具有启示意义。

MATERIALS AND METHODS

质粒与重组杆状病毒构建

将RSV P和EBOV VP35基因克隆至pFastBac HTB-MBP载体，通过Bac-to-Bac系统表达MBP融合蛋白。突变体通过定点突变构建，引物序列见附表。

重组蛋白表达纯化

SF9细胞感染重组杆状病毒72小时后裂解，通过直链淀粉亲和层析纯化蛋白，经超滤浓缩后保存于HEPES-KOH缓冲液。

核酸螺旋底物制备

通过退火HEX标记链与未标记互补链制备RNA/DNA杂交底物，包括标准RNA螺旋（R/R*）、3′/5′悬末端底物及平末端结构，所有寡核苷酸序列见附表。

NTP酶活性检测

采用比色法测定NTP水解产生的无机磷酸含量，反应体系含50 mM HEPES-KOH (pH 7.5)、100 mM NaCl、2 mM MgCl₂，结果取三次重复实验平均值。

凝胶迁移与解链实验

dsRNA结合实验使用DIG标记的200 nt EGFP转录本，蛋白-RNA复合物经蛋白琼脂糖凝胶分离后转膜检测。解链实验在含1 mM Mg²⁺标准体系中进行，反应产物通过15%非变性PAGE分离，Typhoon 9500成像仪扫描HEX信号。

RSV突变病毒拯救

基于pCC1载体构建含T7启动子、RSV A2基因组（含KGK/AAA突变）、HDV核酶和T7终止子的感染性克隆，与辅助质粒（pCDNA3.1-N/P/M2-1、pVSV-RSV-L）共转染BSRT7/9细胞，盲传后通过Hep-2细胞扩增病毒。

免疫荧光与Western blot

感染96小时后细胞用4%多聚甲醛固定，抗RSV-GP抗体和一抗FITC标记二抗染色，DAPI复染核后共聚焦显微镜观察。蛋白样品经SDS-PAGE分离后转PVDF膜，抗体孵育后化学发光检测。

免疫共沉淀与微型基因组实验

细胞裂解液与抗体、蛋白A/G磁珠共孵育后Western检测结合蛋白。微型基因组实验通过共转染荧光素酶报告质粒与病毒蛋白表达质粒，双荧光素酶系统定量复制效率。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢湖北大学生命科学学院陈明周教授提供RSV微型基因组系统。本研究由国家重点研发计划、国家自然科学基金、广州国家实验室重点项目和湖北省自然科学基金资助。