蝙蝠源丝状病毒包膜糖蛋白生物学特性比较研究及其在宿主嗜性与致病性中的意义

本研究系统比较了蝙蝠源丝状病毒（BatFiloVs）包膜糖蛋白（GP）的生物学特性，包括病毒颗粒形态、抗原差异性、单克隆抗体（MAb）中和活性、细胞附着因子（如hTIM-1、DC-SIGN、hMGL）利用效率及细胞嗜性。研究揭示BatFiloVs GP与尼曼匹克C1（NPC1）受体互作的关键氨基酸差异，为评估其跨种传播风险及开发广谱抗病毒策略提供关键数据。

　　

丝状病毒（Filoviruses）是一类可引起严重出血热的病原体，其中埃博拉病毒（EBOV）和马尔堡病毒（MARV）对人类具有高致病性。近年来，通过高通量测序技术，在蝙蝠中陆续发现多种新型丝状病毒，包括Lloviu病毒（LLOV）、Bombali病毒（BOMV）、孟拉病毒（MLAV）和德宏病毒（DEHV），这些蝙蝠源丝状病毒（BatFiloVs）的生物学特性尚不明确。本研究聚焦于BatFiloVs的包膜糖蛋白（GP），系统比较了其结构与功能特性，旨在评估其潜在致病性与宿主范围。

GP一级结构比较

通过系统进化分析，BatFiloVs的GP与已知丝状病毒类似，分为EBOV样和MARV样两大群。LLOV和BOMV的GP更接近EBOV，而MLAV和DEHV的GP更接近MARV。所有GP均含有信号肽、 mucin样结构域（MLD）、弗林蛋白酶切割位点、保守半胱氨酸残基及跨膜区。其中，MLAV GP预测含有两个弗林蛋白酶切割位点（RSKR和KKKR），后者可能为主要切割位点。N-糖基化和O-糖基化位点数量在不同病毒间存在差异，例如EBOV GP有17个N-糖基化位点，而BOMV仅有9个。这些糖基化差异可能影响GP与宿主细胞的相互作用。

病毒样颗粒（VLP）形态

通过电镜观察，表达BatFiloVs GP、核蛋白（NP）和基质蛋白（VP40）的VLP均呈现丝状形态，表面有密集的刺突结构，直径约80-90 nm，长度不一。BOMV VLP直径略小，但所有BatFiloVs VLP形态均与EBOV和MARV相似，表明这些蛋白共同介导了病毒颗粒的组装与形态发生。

抗原性差异

通过小鼠抗VLP血清的ELISA实验，发现各BatFiloVs GP抗原具有高度特异性，同源血清反应强烈，而异源交叉反应较弱。抗EBOV血清仅与BDBV和RESTV GP有轻微交叉反应，其他血清均表现为型特异性，提示BatFiloVs GP在血清学上彼此独立，可用于特异性抗体检测。

单克隆抗体中和活性

利用假病毒系统评估已报道的抗EBOV和MARV GP单克隆抗体（MAb）的中和活性。结果显示，靶向GP2内部融合环的广谱抗体6D6可有效中和LLOV和BOMV假病毒，但对MLAV和DEHV无效。抗EBOV GP抗体ADI-15946对BOMV有微弱中和作用，而mAb114（已获批用于埃博拉治疗）仅对EBOV和BDBV有效。抗MARV GP抗体MR191对DEHV有部分中和活性，但对MLAV无效。这些结果表明，部分保守表位在BatFiloVs中仍存在，为广谱抗体药物设计提供线索。

细胞附着因子利用效率

假病毒实验显示，所有BatFiloVs均可利用人TIM-1（hTIM-1）促进细胞入侵，但效率各异。LLOV GP与EBOV GP类似，在hTIM-1表达细胞中感染性提高约50倍，而BOMV、MLAV、DEHV和MARV仅提高约10倍。在表达C型凝集素DC-SIGN的细胞中，LLOV和EBOV假病毒感染性增强最显著（>30倍），而MLAV和DEHV仅提高4倍。在hMGL表达细胞中，EBOV、RESTV和MARV假病毒感染性提升显著（6-12倍），而BatFiloVs提升较弱（2-4倍）。这些发现表明，BatFiloVs利用宿主附着因子的能力普遍低于高致病性丝状病毒，可能与其低致病性相关。

细胞嗜性分析

通过21种不同来源的细胞系（包括人、猴、蝙蝠等）感染实验，发现BatFiloVs假病毒具有广泛的细胞嗜性。值得注意的是，MARV和DEHV假病毒无法感染Yaeyama flying fox（FBKT1）细胞系，而MLAV假病毒可感染该细胞系。序列分析显示，MLAV GP与NPC1结合的关键氨基酸（I113和V114，EBOV编号）与MARV和DEHV不同，可能解释了这一差异。此外，BOMV假病毒在安哥拉游离尾蝠（Mops condylurus）来源的细胞系（MoKi3 C1、MoKi3-P、MoLu6 Prim）中感染性显著高于其他病毒，提示BOMV对其天然宿主细胞具有适应性。进一步分析发现，BOMV GP的E148残基及宿主NPC1-C环上的独特氨基酸（组氨酸、谷氨酰胺/缬氨酸）可能介导了这一特异性。

讨论与展望

本研究全面揭示了BatFiloVs GP的生物学特性，其与已知高致病性丝状病毒既有相似性，也存在显著差异。例如，BatFiloVs利用C型凝集素的效率较低，可能限制其感染免疫细胞的能力，这与动物模型中观察到的低致病性一致。此外，GP与NPC1互作的氨基酸变异是宿主范围的重要决定因素。尽管BatFiloVs尚未导致人类疫情，但其对人类细胞的感染能力提示潜在的跨种传播风险。未来研究需通过反向遗传学系统构建感染性病毒，并在非人灵长类动物模型中验证其致病性，为风险评估和防控策略提供依据。

材料与方法

本研究使用Expi293F、HEK293T、Vero E6等多种细胞系，通过质粒转染制备VLP和假病毒。病毒中和实验采用抗VSV G抗体预处理去除背景感染性，并通过荧光计数计算感染单位（IU）。电镜样品负染后观察，免疫金染色使用病毒特异性抗体。进化分析采用邻接法，糖基化位点通过NetNGlyc-1.0和NetOGlyc-4.0预测。所有统计分析使用R语言完成。