不连续模板切换介导冠状病毒亚基因组RNA从3?端向5?-3?方向转录生成的新机制及其在OC43和SARS-CoV-2中的实验验证

本研究报告通过优化环状聚合酶延伸反应（CPER）技术，在OC43和SARS-CoV-2病毒基因组中插入mNeonGreen（NG）荧光报告基因，首次实验证实了冠状病毒亚基因组RNA（sgRNA）合成遵循“先到先得”的不连续转录模板切换机制。该机制由病毒复制转录复合体（RTC）介导，通过转录调控序列（TRSB）与5?端前导序列（TRSL）的长距离碱基配对实现，sgRNA的合成效率随其与基因组3?端的距离增加而递减。

　　

ABSTRACT

在冠状病毒（CoV）感染的细胞中，多种结构蛋白和辅助蛋白是通过亚基因组RNA（sgRNA）合成的，这些sgRNA包含共同的5?前导序列和特定的开放阅读框（ORF）。本研究发现，这些sgRNA的丰度与其在基因组中距离3?端的远近有关。因此，编码核衣壳蛋白（N）的sgRNA比编码刺突蛋白（S）的sgRNA更多，这可能是病毒复制和转录复合体（RTC）介导的不连续5?-3?转录模板切换的结果。

INTRODUCTION

冠状病毒感染多种哺乳动物，包括人类。七种已知的人类冠状病毒中，四种（hCoV-229E、-HKU1、-NL63和-OC43）通常引起轻度上呼吸道感染，而三种（SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2）可导致严重急性呼吸综合征（SARS）。冠状病毒分为Alpha-、Beta-、Gamma-和Delta-属。hCoV-229E和hCoV-NL63属于Alpha冠状病毒，而hCoV-OC43、hCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2属于Beta冠状病毒。

冠状病毒基因组RNA（gRNA）是一条单链正义RNA，长度在26至32 kb之间。gRNA编码20至29种已知的病毒蛋白，其5?端有一个帽子结构，后接5?非翻译区（5?-UTR）、一个长的编码区和一个30-60 nt的3?端poly-A尾。病毒基因组约70%编码ORF1a和ORF1b，它们被翻译成两个多蛋白，经翻译后切割成16种病毒非结构蛋白（nsps）。剩余的30%编码结构蛋白（S、E、M和N）和辅助蛋白。辅助蛋白的数量因冠状病毒而异，其功能尚不明确，但可能有助于病毒致病。

病毒基因组5?-UTR包含一个72 nt的前导序列、一个转录调控序列 motif（TRS_L, ACGAAC）以及其他翻译和基因组包装调控顺式元件。每个结构或辅助ORF区域上游的转录调控体序列（TRS_B）被推测控制亚基因组RNA（sgRNA）的合成，这一过程非常活跃。sgRNA通过未知机制被排除在病毒颗粒之外。

RESULTS

Optimizing CPER to construct SARS-CoV-2 and hCoV-OC43 double-stranded circular cDNAs (ds-circDNA)

我们优化了最初为黄病毒设计的基于CPER的系统，用于生成SARS-CoV-2和hCoV-OC43的感染性克隆。通过PCR在接头5?端引入20 bp核苷酸序列，在3?端引入37 bp序列，分别与相应病毒基因组3?-UTR末端和5?-UTR末端重叠，我们制备了用于构建hCoV-OC43和SARS-CoV-2特异性感染性ds-circDNA的接头。

七个重叠的DNA片段（F1至F7）通过PCR从全长（FL）SARS-CoV-2和hCoV-OC43 cDNA中扩增得到，每个片段之间有20-40 nt的重叠。我们通过重叠PCR在给定的cDNA片段中的病毒辅助ORF中插入了自荧光NG报告基因。通过将重叠的cDNA片段与病毒特异性接头退火，我们通过重叠序列的碱基配对生成半环状cDNA，每个片段作为Taq DNA聚合酶的模板/引物填补片段间的缺口，最终产物是病毒特异性的ds-circDNA。

我们通过使用0.01、0.05和0.1 pM的单个片段浓度，通过琼脂糖凝胶电泳确定了个别CPER反应的最佳片段浓度，以生成带有NG插入的FL ds-circDNA。结果显示，使用0.05 pM每个cDNA片段的CPER反应显示出最佳的大于25 kb ds-circDNA条带 production，对应于SARS-CoV-2或hCoV-OC43基因组的FL cDNA。

Optimizing CPER-derived hCoV-OC43 NG-virus production

我们首先通过将CPER衍生的hCoV-OC43 NG-ns12.9的FL ds-circDNA与hCoV-OC43 N蛋白表达质粒（pCOC42）或空对照质粒pFLAG-CMV-5.1共转染HEK293T细胞，并在转染细胞24小时后加入HCT-8细胞来检查其 production。当我们与N质粒pCOC42共转染细胞时，我们观察到NG⁺细胞数量持续增加，但与pFLAG-CMV-5.1共转染则没有。因此，CPER衍生的ds-circDNA与N蛋白表达共转染对于高效病毒 production 至关重要。

我们接下来检查了感染性病毒生成对血清的需求。我们比较了胎牛血清（2% FBS）和新牛血清（2% NCS，FBS的更便宜替代品）在转染细胞培养中于33°C从共转染的HEK293T细胞并与HCT-8细胞共培养生产感染性病毒的情况。我们发现，在2% FBS培养的细胞中，NG⁺细胞数量从第8天（D8）的约70个/视野逐步增加到第10天（D10）的约282个/视野，但在2% NCS培养条件下则没有。数据表明，FBS对于成功繁殖源自通过CPER技术构建的hCoV-OC43 NG-ns12.9 ds-circDNA的重组感染性病毒至关重要。

尽管hCoV-OC43在HCT-8细胞中有效复制，但不会导致可见的空斑，这是确定病毒滴度的传统方法。为了确定适合hCoV-OC43空斑测定和我们CPER衍生的感染性克隆滴定的细胞系，我们确认了LLC-MK2（猴肾细胞）和Mv1Lu（阿留申水貂肺细胞）都对野生型（WT）hCoV-OC43感染敏感。通过比较它们对使用HCT-8细胞产生的WT hCoV-OC43形成空斑的敏感性，我们发现Mv1Lu细胞比LLC-MK2细胞更允许hCoV-OC43空斑形成，通过此测定滴度高出100倍。因此，我们使用Mv1Lu细胞来滴定CPER衍生的感染性NG-hCoV-OC43。

CPER-derived hCoV-OC43 NG-ns12.9 ds-circDNA generates more NG⁺ viruses than CPER-derived hCoV-OC43 NG-Δns2 ds-circDNA

建立基于CPER的系统的最佳条件后，我们接下来检查了将NG报告基因位置性插入hCoV-OC43是否会影响病毒复制效率。hCoV-OC43包含两个辅助ORF，一个ns2位于病毒基因组的5?半部，一个ns12.9位于病毒基因组的3?半部。正如预期，删除或NG插入ns2对hCoV-OC43病毒感染和复制没有损害。

将CPER生成的hCoV-OC43 NG-Δns2或NG-ns12.9的FL ds-circDNA产物与N质粒pCOC42平行共转染HEK293T细胞24小时，然后加入HCT-8细胞共培养指定天数。令我们惊讶的是，我们观察到转染了NG-ns12.9 ds-circDNA的细胞 consistently 显示出比转染NG-Δns2 ds-circDNA更高数量的NG⁺细胞。在D5和D6，NG-ns12.9转染的细胞产生的NG⁺细胞数量几乎是NG-Δns2的五倍。

为了验证这一观察结果，我们在D6从共培养细胞中分离总细胞RNA，通过Northern blot检测病毒RNA转录本，并收集培养上清液用于通过空斑测定进行病毒滴定。使用来自hCoV-OC43 N ORF区域的³²P标记的反义 oligo 探针能够检测病毒+gRNA和所有+sgRNA，我们检查了等量的从每次转染中提取的总细胞RNA，并证明，正如预期，来自NG-ns12.9转染细胞的病毒RNA转录本数量更高，与WT hCoV-OC43感染细胞相当， than that from the NG-Δns2-transfected cells。数据进一步表明NG-ns12.9比NG-Δns2更优选地具有更高的病毒基因组转录和复制。我们还观察到，由于插入的NG报告基因增加了762 nt，NG-ns12.9的个体sgRNA S、HE、ns2和病毒gRNA的预期RNA大小增加。在NG-Δns2中，NG-Δns2 sgRNA和病毒gRNA的大小偏移仅最小，与相应的WT病毒sgRNA和gRNA相比仅额外增加了6 nt，因为NG-Δns2基因组中的NG插入补偿了ns2的部分缺失。

通过使用Mv1Lu细胞的空斑测定进一步验证了CPER衍生的NG-ns12.9比NG-Δns2增加的病毒复制导致更高的病毒滴度。用D6释放到培养上清液中的无细胞病毒粒子感染Mv1Lu细胞，并用半固体DMEM-甲基纤维素覆盖培养基覆盖最多8天。通过荧光显微镜下计算受感染Mv1Lu细胞中的荧光形成单位（FFU），我们观察到NG-ns12.9感染细胞中的FFU出现高于NG-Δns2感染细胞，D8时FFU达到1.2 × 10⁶ FFU/mL for the NG-ns12.9, while only 4.0 × 10⁴ FFU/mL for the NG-Δns2。在滴定板中固定单层的结晶紫染色证实了NG-ns12.9在空斑测定中的复制滴度高于NG-Δns2。

总细胞RNA-seq和病毒gRNA测序表明，两种OC43 NG病毒，NG-ns12.9和NG-Δns2，与ATCC WT hCoV-OC43（GenBank登录号AY391777.1）相比，具有相同的三个突变，这些突变回复到在另一个参考基因组（GenBank登录号NC_006213.1）中观察到的序列。这些突变位于病毒基因组位置nt 32U-to-C在病毒前导区，以及nt 26997G-to-C和nt 27018C-to-U在S ORF。nt 26997G-to-C导致甲硫氨酸变为异亮氨酸。nt 27018C-to-U是沉默突变。数据表明，在CPER衍生的NG-ns12.9和CPER衍生的NG-Δns2之间观察到的病毒转录和复制差异不是由位置性NG插入产生的不同意外突变引起的。

CPER-derived SARS-CoV-2 NG-ΔORF7a ds-circDNA produces more NG⁺ viruses than CPER-derived SARS-CoV-2 ORF3-NG ds-circDNA

优化的基于CPER的系统也应用于生成FL SARS-CoV-2 ORF3-NG和NG-ΔORF7a，分别用于共转染HEK293T细胞，以及SARS-CoV-2 N蛋白表达载体pCSR24 24小时。随后，将SARS-CoV-2许可的BHK21-hACE2细胞直接添加到转染的HEK293T细胞单层中，在指定时间点进行共培养。共培养后12小时，在荧光显微镜成像下对十个显微镜视野中的NG⁺细胞进行量化显示，来自CPER衍生的NG-ΔORF7a的NG⁺细胞数量（约10.8个/视野）比CPER衍生的ORF3-NG转染细胞（约0.9个/视野）高出约10倍。在共培养后24小时，NG-ΔORF7a和ORF3-NG之间的差异增加到约20倍，来自NG-ΔORF7a感染细胞的NG⁺细胞数量约为76.4个/视野，而ORF3-NG的平均值约为3.6个/视野。

通过TCID50滴定收集的培养上清液用于再感染新鲜的BHK21-hACE2细胞，进一步证实了这一观察结果，显示在共培养后12小时，来自CPER衍生的NG-ΔORF7a ds-circDNA的感染性病毒 production 高于ORF3-NG ds-circDNA，到24小时后 production 更高。

随后，我们使用来自SARS-CoV-2 N ORF区域的能够检测病毒+gRNA和所有+sgRNA的反义³²P标记探针，对共培养24小时后提取的总细胞RNA进行Northern blot分析，以确认两种CPER衍生构建体在病毒基因组转录和复制效率上的 observed difference。如所示，与ORF3-NG ds-circDNA转染的细胞相比，NG-ΔORF7a ds-circDNA转染的细胞中病毒RNA水平显著更高。正如预期，病毒ORF7a中的NG插入和相应的缺失导致检测到的sgRNA ORF7a、ORF6、E、M、ORF3、S和病毒gRNA额外增加了351 nt。一致地，ORF3中的NG插入导致ORF3-NG ds-circDNA转染细胞中ORF3和S sgRNA以及病毒gRNA增加了708 nt。

总之，结合hCoV-OC43的结果，这些数据表明，将NG报告基因插入到病毒基因组3?半部的辅助ORF中，比插入到病毒基因组5?半部能导致更多NG⁺病毒 production，这很可能反映了在RTC中不连续5?-3?转录模板切换中，个体TRS_B-TRS_L交叉相互作用的读通效率逐渐降低。

总细胞RNA-seq和作图表明，两种CPER衍生的NG-ΔORF7a和ORF3-NG病毒都包含与原始SARS-CoV-2 cDNA质粒相同的基因组序列，该质粒带有三个沉默突变：nt 26261 (C-to-U)、nt 26542 (C-to-U)和nt 28853 (U-to-A)，表明从NG-ΔORF7a到ORF3-NG观察到的病毒RNA转录和病毒复制差异不是由位置性NG插入产生的不同意外突变引起的。

Infectious virions of hCoV-OC43 NG-Δns2 and NG-ns12.9 exhibit equal infectivity and replication capacity

由于大多数冠状病毒辅助蛋白在病毒复制中不起作用，我们来自hCoV-OC43和SARS-CoV-2的结果促使我们进一步探索我们的位置性NG插入到不同病毒基因组区域是否会影响个体CPER衍生的感染性hCoV-OC43病毒粒子的感染性和复制能力。为了测试两种NG⁺感染性病毒粒子的复制适应性，我们分别用滴定过的hCoV-OC43 NG-Δns2和NG-ns12.9病毒粒子以相同MOI 0.01感染HCT-8细胞。然后，我们使用活体荧光显微镜通过计算5个随机选择的荧光视野中的NG⁺细胞来监测它们3天的复制情况。我们发现，用hCoV-OC43 NG-Δns2和NG-ns12.9感染性病毒粒子感染，从第1天（D1）到第3天（D3）都复制得同样好。在D1（约90个NG⁺细胞/视野）或D2（约300个NG⁺细胞/视野），NG-Δns2与NG-ns12.9感染的HCT-8细胞中的NG⁺细胞数量没有统计学显著差异。对D3细胞培养上清液中收集的无细胞病毒粒子进行的Mv1Lu细胞FFU测定进一步证实了两种病毒具有相似的感染性和复制能力动力学，NG-Δns2病毒滴度达到1.5 × 10⁴ FFU/mL，NG-ns12.9达到2.0 × 10⁴ FFU/mL。

结合我们的总RNA-seq/病毒gRNA测序和作图，上述数据表明，将NG报告基因插入病毒基因组的辅助ORF，无论是朝向5?半部（NG-Δns2）还是朝向基因组的3?半部，一旦病毒粒子产生，不会诱导意外突变，也不会影响感染性病毒粒子的感染性或复制效率。个体病毒是否通过病毒gRNA拷贝数与HCT-8细胞传代至Mv1Lu感染性的相关性表现出不同的感染指数仍有待仔细研究。然而，用于位置性NG插入的CPER策略确实提供了一个简单的工具来 mirror 个体-sgRNA在5?到3?顺序中逐渐降低的读通不连续模板切换介导的TRS_B-TRS_L在RTC中的交叉相互作用的转录效率。

Mapping of the hCoV-OC43 TRS_L and TRS_B in synthesis of individual sgRNAs

每个TRS_B在调控hCoV-OC43 sgRNA合成中的序列部分已知，但尚未被其他实验室验证。为了验证报道的病毒基因组5?端TRS_L与每个TRS_B在调控个体sgRNA合成中的相互作用，我们使用一组特异性引物对来自WT hCoV-OC43感染的HCT-8细胞的总细胞RNA进行了RT-PCR，用于检测每个sgRNA。通过对扩增的RT-PCR产物进行测序，我们证实了报道的病毒基因组5?-UTR中的TRS_L motif由七个核苷酸组成，UCUAAAC（基因组位置，nt 63至69）。在ns2（UCUAAAC，nt 21492–21498）和S（UCUAAAC， nt 23636–23642）的TRS_B中发现了相同的TRS_L序列 motif，这可能介导了与病毒基因组5?前导序列中TRS_L motif的交叉相互作用，用于长距离环化在转录模板切换中，以合成包含共同5?前导序列的个体sgRNA。

ns12.9 sgRNA的TRS_B被定位到S ORF的3?半部，具有UCAAAAC（nt 27682–27688）的序列 motif，与TRS_L motif在第三个位置相差一个核苷酸（下划线标出）。这个TRS_B motif与报道的nt12.9的TRS_B不同。E和M sgRNA是通过使用一个7-nt motif形成的，该 motif也与TRS_L仅在第三个位置相差一个核苷酸（UCCAAAC，nt 27978–27984和nt 28367–28373 respectively）。然而，E sgRNA的TRS_B motif未被报道。这个用于合成E sgRNA的TRS_B位于ns12.9 ORF区域的3?半部，在E翻译起始密码子AUG上游123 nt处。N sgRNA的TRS_B具有UCUAAAU（nt 29065–29071）的序列，如报道所述，但与TRS_L motif在第七个位置相差一个核苷酸。本报告中HE sgRNA的 mapped TRS_B motif与报道的HE TRS_B motif不同，并且是唯一一个包含八核苷酸序列（UAUUAAAC，nt 22337–22344）的 motif，与所有其他 mapped 的7-nt TRS_B motif不同。总之，我们已经验证并定位了所有与病毒基因组5?-UTR中TRS_L motif相互作用的TRS_B motif。我们相信这些相互作用介导了5?前导序列直接跳跃（模板切换）到每个sgRNA的5?端，以在冠状病毒感染期间调控病毒结构或辅助蛋白的翻译。

Role of the mapped ns12.9 TRS_B in sgRNA synthesis and virus production

在定位了hCoV-OC43中所有结构性和辅助性ORF上游的TRS_B motif后，我们检查了 mapped TRS_B在辅助sgRNA合成中的功能。冠状病毒的辅助蛋白通常对病毒复制和感染性病毒 production 是非必需的，但hCoV-OC43 ns12.9最近被报道为一种病毒孔蛋白，对病毒形态发生至关重要。然而，我们显示CPER衍生的hCoV-OC43 NG-ns12.9 ds-circDNA比CPER衍生的hCoV-OC43 NG-Δns2 ds-circDNA表现出更有效的复制和病毒 production。我们研究中 mapped 的TRS_B motif与报道的hCoV-OC43 ns12.9的TRS_B不同。随后，我们检查了将点突变引入我们 mapped 的ns12.9 TRS_B motif如何影响ns12.9 sgRNA的合成和感染性病毒的 production。ns12.9 TRS_B motif中的点突变是随机引入的，作为沉默突变，以便S ORF中个体密码子的编码功能得以维持，用于CPER衍生的hCoV-OC43 NG-ns12.9 ds-circDNA中的正常S表达。

五个突变体，MT-1至MT-5，在我们 mapped 的ns12.9 TRS_B motif UCAAAAC或其相邻区域（上游或下游）引入了突变，与WT NG-ns12.9比较了它们的复制和病毒 production。通过转染HEK293T并与HCT-8细胞共培养7天，我们通过FACS量化了NG⁺细胞的数量及其荧光强度。WT显示约45.6%的NG⁺细胞，较高的NG强度达到中位荧光强度（MFI）为1,921.0。正如预期，我们发现将突变引入ns12.9 TRS_B motif将NG⁺细胞的平均数量降低到17.4%（MT-1）、13.4%（MT-2）、24.6%（MT-3）、11.4%（MT-4）和32.6%（MT-5），它们的MFI也显著下降到69（MT-1）、63.7（MT-2）、63.7（MT-3）、53.8（MT-4）和81.7（MT-5）。MT-3在TRS_B下游紧邻处有突变，显示NG⁺细胞没有显著减少，但MFI显著降低。MT-5包含一个WT TRS_B motif，但上下游相邻区域都有突变，与WT ns12.9 ds-circDNA相比，也显示NG⁺细胞没有显著减少，但MFI显著降低。

共培养7天后分离总细胞RNA用于RT-PCR和Northern blot分析。正如预期，使用中描述的引物对针对WT ns12.9 TRS_B RNA进行的RT-PCR分析显示出一个主要的扩增子（347 bp），对应于由WT TRS_B motif（UCAAAAC，nt 27682–27688）介导的NG-ns12.9 sgRNA。出乎意料的是，将沉默突变引入ns12.9 TRS_B优先产生一个更小的RT-PCR扩增子（276 bp），但有一个弱的347 bp产物。对这个276 bp产物的测序显示，一个替代的TRS_B（UCUAGCA，nt 27753–27759），位于WT TRS_B下游64 nt，被激活用于合成ns12.9 sgRNA。这个在nt 27753–27759的替代TRS_B不是在nt 27771–27777报道的TRS_B。对产物1*、1和1#的测序显示，1*和1#产物分别具有来自MT-1和MT-5的预期序列，但来自MT-2的1产物显示出来自引入突变的衍生TRS_B motif序列，要么是UCUAGAC，要么是UCACAGAC。总之，这些数据表明 mapped 的TRS_B及其周围序列在指导正确使用ns12.9 TRS_B用于其sgRNA合成中具有重要作用。

通过Northern blot分析，我们进一步显示了通过将点突变引入ns12.9 TRS_B motif对ns12.9 sgRNA合成的抑制。然而，其他sgRNA种类的谱图看起来相对正常，但条带密度表达显著降低。通过Western blot分析 spike (S) protein production 显示了类似的结果。这些数据表明，通过点突变破坏ns12.9 TRS_B motif功能可以抑制不连续转录和蛋白质翻译。这与先前报道的ns12.9是一种负责病毒粒子形态发生和致病性的病毒孔蛋白一致。

The mapped TRS_B in hCoV-OC43 M expression is essential for sgRNA synthesis and virus production

我们进一步检查了 mapped 的M TRS_B在sgRNA合成和病毒 production 中的功能。我们通过6 bp linker-scanning策略，将点突变引入 mapped 的TRS_B motif，用于从hCOV-OC43 NG-ns12.9 ds-circDNA合成M sgRNA。一个6碱基 linker, CACGAU, 被逐步从5?到3?引入，以扫描覆盖ORF E和ORF M之间TRS_B motif的15 bp序列。在随后的CPER反应中总共创建了四个突变体（MT-6至MT-9）。

在转染HE